牛结核病分子病原学分型方法

第五节　牛结核病分子病原学分型方法

过去，人们普遍认为牛结核病主要由牛型结核杆菌引起。但近年来的研究表明，奶牛结核病原经分子生物学分型主要为人型结核分枝杆菌。牛型菌既能感染人和猪，也能使其他动物致病。人结核和牛结核之间可以相互感染，禽结核杆菌也可以感染人和牛。牛分枝杆菌主要感染不同种属的温血动物。除了哺乳动物外，一些禽类也对牛结核很敏感，包括鹦鹉、石鸽、北美洲乌鸦。人对牛结核也很敏感，且很多病例与感染动物有接触史。

在全球范围内，家养牛被认为是牛结核分枝杆菌的主要宿主。但是，近年来发现有几种野生动物是贮存宿主，包括新西兰的刷尾袋鼯、密歇根的白尾鹿、水牛和南非的几种羚羊，其他如大象和犀牛也是牛结核分枝杆菌的宿主。因此，牛结核病的流行严重危害公共卫生安全，所以，做好牛结核病的诊断和对牛结核病流行病学调查，对公共卫生有重要意义。

一、常用的结核杆菌分子流行病学分型方法

1.结核分枝杆菌复合群标准分型方法

Van Embden推荐IS6110-RFLP分型为结核分枝杆菌复合群标准分型方法。IS6110最初由Thierry等人报道，属插入序列IS3家族，因其在基因组中插入位置和拷贝数不同可对菌株进行鉴别。通常，结核分枝杆菌复合群IS6110拷贝数在0～25个之间，M. bovis有1～3个拷贝，BCG含单一拷贝（命名为IS987），而非结核分枝杆菌无IS6110拷贝。IS6110长度约为1.35kb，其上有PvuⅡ、BamHⅠ等酶切位点，两端为28bp的反转重复顺序。DR区和ipl区是IS6110插入的热点区域。IS6110-RFLP分型技术是从培养基上获得的结核菌经DNA提取后，Pvu II限制性内切酶消化，酶切片段在琼脂糖凝胶上电泳分离。转移并固定到膜上后进行杂交分析，然后进行显色或显影。 DNA指纹结果采用Gelcompare软件或Taxotron软件进行分析，计算相似系数进行簇型分析。

对于以IS6110为基础的DNA指纹技术，有三个指标是非常关键的，即限制性内切酶的特异性、探针的性质和恰当的分子标准。推荐使用Pvu II作为限制性内切酶是由于Pvu II在IS6110上仅有一个酶切位点，即对IS6110序列仅切割一次。探针经PCR扩增后可用地高辛或过氧化物酶等非发射性物质标记，并对应于IS6110 Pvu II位点右侧的245bp片段。实验中以supercoiled DNAladder和HaeIII消化的小X174混合物为内标准，覆盖了IS6110 0.9～10kb大部分杂交片段。结核分枝杆菌参比菌Mt14323 DNA为外标准，该菌株经Pvu II消化后得到12个分布较均匀的条带。

虽然，IS6110-RFLP是推荐的标准方法，但也有一些局限性。首先是需菌量大，通常需要3～4周进行培养以获得足量的DNA；其次是操作复杂，需要数周才能得到期望的结果；再次是需要软件支持，对于含IS6110拷贝数少甚至是零拷贝的菌株很难鉴别。因此，国际上逐渐建立一些以PCR为基础的DNA分型方法，通过多种分型技术多步分析的方法替代标准指纹分型，以达到快速鉴定的目的。

2.分枝杆菌散在重复单位（MIRU）分型技术

分枝杆菌散在重复单位（MIRU）分型技术是近年来发展起来的以PCR为基础的分型技术。 MIRUs为40～100bp的DNA元件，通常以串联重复形式散布在结核分枝杆菌复合群基因组中。H37Rv基因组中含41个MIRU区，其中有12个区具有多态性，其拷贝数在不同菌株之间存在差异。MIRU技术利用不同菌株之间这12个区拷贝数的差异达到鉴定菌株的目的。由于该方法对结核分枝杆菌的鉴定结果以数字表示，结果分析简单明了，便于对不同实验室之间的结果进行比较，且分辨力与IS6110-RFLP分型接近，只需一天即可完成对菌株的鉴定，因此，被认为是有望替代IS6110-RFLP分型技术的新方法。Supply等采用荧光标记引物，利用多重PCR技术，在一管内扩增三对引物，利用Genescan和Genotyper软件对结果进行分析，使MIRU技术成为一种自动的高通量的快速分型方法，对结核分枝杆菌大规模的基因分型提供了一个有利的工具。

3.可变DNA串联重复区（Variable Number of Tandem DNA Repeats，VNTR）

Richard Frothingham等介绍了一种以PCR为基础的分型方法VNTR。它是基于识别H37Rv基因组的11个串联重复区而建立的方法。这11个重复区由5个多态性串联重复区（MPTR）和6个有代表性的直接重复区（ETRs）组成。近来的研究表明，仅用5个区（ETR-A-E）就对结核分枝杆菌调查有足够的分辨力。针对这11个区设计引物并对不同DNA样品进行PCR扩增，根据PCR产物的片段大小来决定每一区串联重复序列的拷贝数。VNTR除具备以PCR为基础的分型方法的所有优点外（即快速、需样量少等），还可利用不同的拷贝数产生简单的数字结果，从而便于分析。

Ingrid Fillio等报道VNTR分型方法有助于构建结核分枝杆菌复合群的进化树，认为该方法可以提供额外的物种进化的信息。但同时，Ingrid Filliol等提出单独使用VNTR分型方法的分辨能力较差（HGI＜90%），而当与Spoligotyping和DRE-PCR结合起来的分辨能力则明显增强（HGI＝0.992）。因此，不主张用VNTR分型单独作为一线指纹方法，而强调将两个以上分型方法结合起来的多步筛选方法进而提高分辨力。

4.间隔区寡核苷酸分型技术

间隔区寡核苷酸分型近年来成为进一步检测MTB复合群并对其分型的方法。该方法的基本原理是基于直接重复区（DR区）的多态性。 Hermans等人描述，DR区只出现于结核分枝杆菌复合群中，由若干个保守的长为36bp的直接重复序列组成，并被非重复序列即间隔区分隔开。每个间隔区序列长为34～41bp。Spoligotyping通过扩增这些间隔区，将带有标记的扩增产物与膜上结合的43个寡核甘酸探针杂交，再通过ECL化学发光法检测，即可得到较为特异的结果。通常间隔区的顺序在所有菌株都是相同的，但可能会发生某一间隔区的插入或缺失，因此，利用Spoligotyping就可以对结核分枝杆菌进行株水平的鉴定。由于所有的M.bovis和M.bovis BCG菌都缺乏39～43间隔区而含有33～38间隔区，因此，利用spoligotyping技术可以从结核分枝杆菌复合群中分辨出M.bovis和M.bovis BCG，但这种方法还不能从M. bovis BCG中区分M.bovis。目前，商品化的Spoligotyping试剂盒已经上市，一次可以作45个样本，这也促进了该方法的进一步推广。与IS6110-RFLP相比，Spoligotyping的最大优点是它可对结核分枝杆菌进一步分型到亚种水平，对含IS6110拷贝数较少的菌株的分辨力较高，可以进一步鉴定IS6110-RFLP分型不能鉴定的菌株。因此，Spoligotyping技术在世界范围得到普遍推广和应用，具有较为广泛的应用前景。

5.扩增片段长度多态性分析（AFLP）和荧光扩增片段长度多态性分析（FAFLP）

AFLP基于选择性扩增基因组DNA限制性片段，通常这一技术包含三个步骤：①DNA的限制性酶消化和寡核苷酸接头的连接。②选择性扩增一系列限制性片段。③扩增片段的凝胶分析。

其原理是DNA被两个限制性内切酶如EcolR I-Mse I切割后，同时使用两种酶的接头。双链接头连接到DNA片段的末端，接头和限制性位点的序列作为引物结合的位点，然后进行PCR扩增。这样，不用预先知道核酸序列就可以获得一系列限制性片段。 AFLP与RFLP两种指纹技术名称相似，都是利用限制性内切酶获得限制性片段，二者的差别在于前者是展示限制性片段的存在或缺失，后者则是展示片段长度的差异。使用AFLP方法的优点是扩增片段的数量及扩增条带的数量都是可控的。并且AFLP技术在基因和物理图谱之间架起一道桥梁：首先AFLP是揭示限制性片段长度多态性的有效工具；其次，它可以用于检测相应的基因组克隆;再次，该技术还可用于克隆化的DNA片段，诸如质粒的指纹检测。

荧光扩增片段长度多态性分析（FAFLP）即一个引物用荧光标记的扩增片段长度多态性分析。选用EcoR I-Mse I共同切割DNA。与EcoR I衔接头对应的引物用荧光标记。 FAFLP是基于整个基因组而不是基于可移动元件的插入位点，展示了独特的精确片段尺寸以及独特的重复性特征。对于仅有一条带之差的菌株之间也能识别。正是这些特点，使该方法优于那些Southern-blot基础上的分型方法。对于含多个IS6110拷贝的菌株来说，FAFLP分辨能力高于Spoligotyping，而对于含IS6110低拷贝的菌株，两者的分辨能力则相反。当FAFLP与IS6110-RFLP两种方法结合起来时，即使对含IS6110低拷贝的菌株分辨能力也很高。 FAFLP不但能揭示那些IS6110-RFLP分型所不能提供的菌株的传播，而且还从种水平揭示结核分枝杆菌的进化。

6.随机扩增多态性DNA（RAPD）

RAPD在聚合酶链式反应（PCR）的基础上，采用随机核苷酸序列（10个碱基）扩增基因组DNA的随机片段，获得了一种新的分子标记。RAPD技术是PCR技术的延伸，其原理是利用一系列（通常是数百个）不同的碱基随机排列的寡聚核苷酸单链作为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离、EB染色或放射性自显影来检测扩增DNA片段的多态性，这些扩增的DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。 RAPD技术因其简便快捷、多态检出率高，所需DNA量少和不需杂交等优点，越来越受到重视，但是，由多种成分参加的生化反应，尽管其反应灵敏度高，可是影响因素较多，存在着结果重复性差、分型过少的缺点。

7. DNA芯片技术

DNA芯片可以为快速检测大量DNA序列提供一种实用工具。芯片由成千上万的印在一个有限表面上的高密度寡核苷酸阵列组成。通过在芯片上分析分枝杆菌DNA的杂交情况，可同时检测不同基因位点的基因变异。芯片已被用于MTB的分类鉴别和药敏试验，理论上讲，DNA芯片也可用作分子流行病学工具，探查全基因组而非探查小的插入序列。用全序列作为DNA芯片的模板，可分析其他MTB分离株的基因组，以及其他分枝杆菌属分离株的基因组。识别相同和不同的序列区可揭示重要的临床和流行病学现象。DNA芯片是一种有前景的工具，芯片技术原则上可使菌株鉴别、药敏试验和分子分型在一次试验的不同进化水平上同时进行，可能很快在精确研究分枝杆菌种系发生中使用。

二、DNA分型技术在结核病流行病学中的应用

1. DNA分型技术在结核杆菌传播中的检测应用

运用分子流行病学可研究结核菌的传播。依据是来自同一祖先的菌株可以表现出相同的DNA指纹特征。 “簇”代表的是具有相同或高度相似DNA指纹特征的一组结核分枝杆菌。通过成簇率的高低就能反映出结核菌的传播情况。成簇菌株的百分比上升，表明近期有高水平的传播。通过对固定人口一定阶段的研究，运用DNA指纹方法，包括IS6110-RFLP及以PCR为基础的快速分型方法，就可鉴别造成疾病传播的菌株进而追踪其传染源。此外，运用这些分子生物学手段，还可判断造成结核的因素是接触结核菌还是潜在结核菌的再发。可见通过成簇率的研究可达到发现结核菌传播并预防其传播的目的。

一些研究表明，将IS6110-RFLP与Spoligotyping两种方法结果结合起来能反映出真正的分簇结果。然而，对于某些含IS6110低拷贝的菌株来说，这两种方法结合可能会高估了成簇率。尽管如此，相对于单独使用IS6110-RFLP或Spoligotyping一种方法而言，两种方法结合显然增强了对低拷贝结核菌的分辨能力。从而更为准确地反映结核菌的传播。Christophe Sola等以Spoligotyping分型为首选方法，结合IS6110-RFLP或DRE-PCR等方法，构建结核分枝杆菌种系发生树，对研究结核菌传播和菌种起源起到重要的作用。

2. DNA分型技术在结核杆菌耐药性检测中的应用

20世纪50年代以来，结核菌耐药成为困扰人们的一个突出问题。因此，在早期阶段识别耐药菌的传播以防更大范围的传播就显得尤为重要。D.VanSoolingen认为，DNA指纹分析在结核分枝杆菌耐药性如INH耐药性传播鉴定中可能发挥重要作用。通过IS6110 DNA指纹成簇数的比较，研究人员发现，带有katG基因315位点的突变的结核分枝杆菌成簇数显著高于其他位点突变的INH耐药的结核分枝杆菌。这些研究表明，带有不同碱基突变的INH耐药的菌株有不同的传播能力。可见DNA指纹技术在鉴定结核分枝杆菌耐药性传播方面也起到重要作用。

3. DNA分型技术检测实验室交叉污染

实验室交叉污染一直是进行结核分枝杆菌分子生物学诊断和鉴定中不可忽视的问题。在病人取样、镜检、标本接种中的任何阶段的交叉污染都可造成假阳性的实验结果。尤其是当实验室处理较多的阳性标本时，交叉污染的可能性就大大提高了。据报道，交叉污染率有些地区甚至高达16%。以前实验室一直以不寻常的药敏特点、独特的生化特点和噬菌体类型来判断交叉污染。但大多数分枝杆菌具有相同的生化和药敏类型。因此，有必要采取更为准确和快速的方法来确定实验室交叉污染。

Peter M.Small等指出，采用RFLP等DNA指纹分型方法对于分枝杆菌菌株有较好的分辨能力，并且对于实验室交叉污染造成的假阳性提供了具有说服力的旁证。他们还建议，如果在一周内培养出的分枝杆菌具有相同的DNA指纹特点而没有流行病学联系，就可认定为实验室交叉污染。涂片阴性而培养阳性或培养产量很少的标本均应进行DNA指纹分析以排除交叉污染的可能性。目前，一些快速的以PCR为基础的分型方法诸如VNTR和Spoligotyping等已被用于这一目的，这些都为鉴定和排除交叉污染提供了可靠的依据。

4.牛分枝杆菌（M.bovis）和卡介苗（BCG）的鉴定

利用Spoligotyping技术可以从结核分枝杆菌复合群中分辨出M.bovis和M.bovis BCG。因为，采用Spoligotyping技术得出的结果为：所有的M.bovis和M.bovisBCG菌株都缺乏39～43间隔区而含有33～38间隔区，这一结果具有特征性。但这种方法还不能从M.bovis BCG中区分M.bovis。但可通过IS1081指纹图谱分型，BCG菌株的带型中含有一个8kb的Pvu II片段，而其他结核分枝杆菌复合群菌株则没有，因此可从结核分枝杆菌复合群中鉴定出BCG。

国内目前已应用DNA指纹技术对结核分枝杆菌进行了较为广泛的研究。利用IS6110-RFLP分型技术对一些地区的结核分枝杆菌进行流行病学调查发现，北京与其他地区结核菌临床分离株遗传关系较近，在男性中的传播频率可能高于女性。所有这些研究都为调查国内结核分枝杆菌的流行和传播提供了可靠的依据。

三、结核分枝杆菌DNA分型技术的发展前景和展望

从20世纪90年代到现在，已有10余种DNA分型技术用于结核病的流行病学调查。除上述方法（IS6110-RFLP、Spoligotyping、VNTR、AFLP、FAFLP、LMPCR、DRE-PCR）外，其他的方法如混合连接PCR（Mixed-linker PCR），IS6110反转PCR，IS6110 ampliprinting，随机引物PCR（APPCR）以及GC丰富区重复序列（PGRS）多态性等技术也在鉴定结核菌传播，追踪传染源，预防和控制结核菌的传播和流行方面起到重要作用。并且这些方法也在逐步改进以期获得更为快速和准确的结果。比如，Spoligotyping技术通常使用43个间隔区寡核甘酸为探针，A.G.M.van Zanden等在这43个探针的基础上，再增加51个新的间隔区序列，实验结果表明，通过引用这51个核苷酸后，不但增强了Spoligotyping技术的分辨力，而且还可以在北京基因型内再进一步分型。

总之，DNA指纹技术在流行病学中的应用是分子生物学与流行病学有机结合的一个典范，它对结核病的实验室技术是一个推动。虽然这些分型方法对分枝杆菌菌种鉴定能力有限，但可以给研究者提供解决问题的思路和途径。有理由相信，随着DNA分型技术尤其是以PCR为基础的DNA分型技术的不断完善，将会获得更为快速和准确的结果从而更好地为人类服务。