牛结核病免疫机制

第四节　牛结核病免疫机制

结核的免疫属于感染免疫，又称带菌免疫，即只有当结核分枝杆菌或其组分存在体内时才有免疫力，一旦体内的结核分枝杆菌或其组分全部消失，免疫也随之消失。

很少有外源性微生物能引发像结核分枝杆菌那样的广泛免疫反应，来自结核分枝杆菌与宿主相互作用的强烈选择性压力导致抗结核感染免疫除了常规T细胞反应外，还引发一些特殊的T细胞免疫反应。T淋巴细胞介导的免疫应答是一个连续的过程，可分为三个阶段：①T淋巴细胞特异性识别抗原（初始或记忆T细胞膜表面的受体与APC表面的抗原肽-MHC复合物特异性结合的过程）；②T细胞活化、增殖和分化；③效应T细胞发挥效应。

T细胞的活化需要双信号的刺激，第一信号来自抗原，提供方式是APC表面的抗原肽-MHC复合物与受体的相互作用和结合，该信号确保免疫应答的特异性；第二个信号是微生物产物或非特异性免疫针对微生物的应答成分，该信号确保免疫应答在需要的条件下才能发生。当只有第一信号时，T细胞处于无应答状态。

T细胞活化引起细胞分裂（大量增殖，达到整体功能所需的数量水平）和分化（使T细胞具有分泌细胞因子或细胞杀伤的功能）。淋巴因子的分泌是T细胞活化的主要表现形式。不同的抗原刺激可使初始T细胞分泌不同种类的细胞因子，从而产生不同的效应，而白细胞介素2是初始T细胞产生的最重要的细胞因子。细胞毒性T细胞具有特异性的杀伤功能，主要是细胞浆内形成了许多膜结合性的颗粒，这些颗粒包含穿孔素（成孔蛋白）和颗粒酶等多种介质。穿孔素可对靶细胞打孔，颗粒酶是一组丝氨酸酯酶，它进入靶细胞胞浆，使靶细胞凋亡。靶细胞凋亡后，暴露抗原，从而被抗体消灭。

随着抗原的清除，大多数活化T细胞死于细胞凋亡，以维持自身稳定的基础状态。少数T细胞分化为长寿命的记忆细胞，在再次抗原刺激时发挥快速的免疫应答作用。

T细胞不能直接和胞内菌作用，必须先与感染细胞反应，导致细胞崩溃，释放出结核分枝杆菌。机体对结核分枝杆菌虽能产生抗体，但抗体只能与释出的细菌接触起辅助作用。结核分枝杆菌侵入呼吸道后，由于肺泡中80%～90%是巨噬细胞，10%是淋巴细胞（T细胞占多数）；原肺泡中未活化的巨噬细胞抗菌活性弱，不能防止所吞噬的结核分枝杆菌生长，反可将结核分枝杆菌带到他处。但可递呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏。致敏淋巴细胞可产生多种淋巴因子，如IL-2、IL-6等，它们与TNF-α共同作用，可杀死病灶中的结核分枝杆菌。

一、常规T细胞免疫反应

CD4^＋T和CD8^＋T细胞在抵抗结核分枝杆菌感染中均有重要作用。CD4^＋T细胞是介导细胞内免疫反应的主要免疫细胞，主要分泌IFN-γ等细胞因子； CD8＋T细胞主要发挥直接细胞溶解活性，二者共同激活巨噬细胞，巨噬细胞被激活后，与T细胞一起促进结核肉芽肿的形成，肉芽肿由巨噬细胞、CD4^＋T和CD8^＋T细胞构成，中心包裹着结核杆菌，抑制结核杆菌扩散，与此同时，灶内巨噬细胞将特异性抗原递呈给周围淋巴细胞。感染3～6周后，机体产生特异性细胞免疫，同时也出现超敏反应。病灶中结核分枝杆菌细胞壁磷脂，一方面刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞，后者相互融合或经核分裂形成多核巨细胞（即朗罕巨细胞）；另一方面抑制蛋白酶对组织的溶解，使病灶组织溶解不完全，产生干酪样坏死，周围包着上皮样细胞，外有淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞，形成结核结节（即结核肉芽肿）。敲除CD4^＋T细胞基因的小鼠研究发现，CD4^＋T细胞亚群对于控制感染是必需的。 CD4^＋T细胞识别MHC-Ⅱ类分子呈递的抗原，这在抗结核分枝杆菌感染的免疫保护中非常重要。CD4^＋T细胞的另一个重要作用是分泌IFN-γ，IFN-γ是抗结核分枝杆菌感染免疫反应中的关键性细胞因子。除分泌IFN-γ外，CD4^＋T细胞还有非IFN-γ依赖性抑制细胞内病原体的机制，且在二次应答中占优势。

幼稚型CD4^＋T细胞可以分化为Th1细胞和Th2细胞，尤其Th1细胞在抗结核分枝杆菌感染的免疫中起到非常重要的作用。两种辅助性T细胞分泌不同的细胞因子，在免疫反应中起到不同的作用。

Thl细胞能够分泌IFN-γ、IL-2和IL-12等，这些细胞因子在抗结核分枝杆菌感染中对机体起到保护性作用。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，这些细胞因子能够抑制1型T细胞介导的免疫反应，并且能够使巨噬细胞失活。有的研究发现，随着病程的进展，Thl型反应向Th2型反应转化，同时细胞介导的免疫反应受到抑制。 CD4^＋T细胞分化为Thl型细胞是由早期细胞因子包括IL-12、IL-18和共刺激分子共同作用的结果。这些细胞因子部分是由Toll样受体激活诱导产生的。

由接种BCG或结核分枝杆菌自然感染导致的Th1细胞激活，对于完全性抗结核感染免疫是不够的，产生这种现象的机制目前尚需进一步深入研究。 IFN-γ在抗结核中的作用是不容置疑的，其他细胞因子特别是α肿瘤坏死因子（TNF-α）、淋巴毒素-α3，通过调控结核肉芽肿结构的形成与完整性，参与抗结核免疫。

研究表明，吞噬体内的结核分枝杆菌能够刺激MHC-I类限制性CD8^＋T细胞反应，参与结核防御反应。存在于吞噬体内的结核分枝杆菌，可以穿过吞噬体膜得到宿主胞浆中的营养成分，这种机制也使结核分枝杆菌抗原能与MHC-I类分子接触。此外，结核杆菌另一种抗原递呈途径可能是结核分枝杆菌菌体脂蛋白和糖脂类抗原成分渗入到吞噬小泡膜上，通过细胞膜循环穿梭于膜性结构之间，也能到达旁侧细胞上。已经有实验证据表明，旁侧抗原递呈细胞通过吞噬含结核抗原的膜性小泡能诱导MHC-I类限制性CD8^＋T细胞反应，含结核抗原成分的吞噬小泡也能从凋亡巨噬细胞上释放出来，这在结核患者坏死病灶中含量非常丰富。因此，可能有些结核分枝杆菌抗原经过这种途径转移至周围树突细胞，再通过MHC-I类抗原递呈途径促进CD8^＋T细胞免疫反应。这些不同的抗原递呈途径保证了有足够的MHC-I类递呈系统对结核抗原的递呈，抗原转运对于启动CD8^＋T细胞的细胞反应是非常重要的，确保了有效的树突细胞刺激。受染巨噬细胞的直接MHC-I类抗原加工在急性感染期是主要的，这样能促使CD8^＋T细胞集中攻击受染靶细胞。

抗原递呈细胞（APC）还可通过MHC-I类分子将结核分枝杆菌的降解肽段和脂抗原递呈给CD8^＋T细胞，CD8^＋T细胞被激活后，能溶解被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞，同时通过释放含颗粒素和穿孔素的颗粒消灭细菌。CD8^＋T细胞与CD4^＋T细胞相似，也能产生IFN-γ，但它们的主要功能是杀灭受染靶细胞，通过溶解受染细胞，CD8^＋T细胞能使结核分枝杆菌从防御能力弱的细胞转移至高免疫活性细胞，从而达到有效灭杀。表达粒溶素和穿孔素的人类CD8^＋T细胞能直接杀灭结核分枝杆菌，通过穿孔素在巨噬细胞上形成小孔，粒溶素进入巨噬细胞内杀灭结核分枝杆菌。

二、非常规T细胞免疫反应

结核分枝杆菌基因组DNA存在大量编码脂质代谢酶类，造就了结核分枝杆菌特殊的蜡质样细胞壁，致使结核分枝杆菌能在巨噬细胞内生存，同时引发大量针对脂质抗原的特殊免疫反应。由CD1分子呈递的针对结核分枝杆菌糖脂抗原的T细胞反应和由表达γδT细胞受体的T细胞反应在结核杆菌免疫中具有独特作用。CD1分子由CD1a、CD1b、CD1c和CD1d4种，其中CD1a、CD1b、CD1c存在于灵长类、豚鼠身上，但在小鼠缺乏，CD1d分子存在于所有动物身上。CD-糖脂特异性T细胞反应也产生IFN-γ，也表现溶细胞活性。结核分枝杆菌细胞壁内存在大量可以被CD1分子特异性呈递的糖脂，如磷脂酰肌醇甘露糖苷、阿糖甘露聚糖脂衍生物、分枝菌酸和己糖-1-磷酸-类异戊二烯类等。CD1分子存在于糖脂抗原递呈细胞中的不同部位，CD1a特异性主要存在于细胞表面和早期循环内吞体； CD1b主要存在于晚期内吞体（溶酶体）； CD1c存在于细胞表面以及不同时期内吞体，既然结核分枝杆菌能将吞噬体滞留在早期阶段，CD1a、CD1c就能与结核抗原接触，结核分枝杆菌能将糖脂抗原丢弃在吞噬体内，进入晚期内吞体（溶酶体）后，能与那里的CD1b相互作用。巨噬细胞还能将含丢弃的结核杆菌糖脂抗原的内吞体释放到细胞外间隙中，这样，可以将结核糖脂抗原传递给旁侧抗原呈递细胞。

CD1a、CD1b、CD1c在树突细胞中表达丰富，而在巨噬细胞中缺乏，而CD1b在受染巨噬细胞中表达下降，因此，来自受染巨噬细胞的结核糖脂转移到旁侧树突细胞构成了促进CD1递呈的抗原递呈重要途径，CD1d分子似乎在结核抗原呈递中作用不大。表达γδT细胞受体的T细胞也参与抗结核免疫，在小鼠这些细胞参与高剂量结核菌苗接种的保护免疫，调节结核肉芽肿的形成。人类γδT细胞能被一类含磷非肽类抗原刺激，明显不依赖任何一种抗原递呈限制系统。这些含磷配体包括异戊二烯基焦磷酸—核苷酸交联物，都是结核分枝杆菌含量丰富的，含磷配体刺激表达Vγ2δ2链结合物的γδT细胞，而Vγ2δ2T细胞构成γδT细胞重要亚群，占外周血T细胞的5%。这一大类γδT细胞在受含磷配体刺激后稳定地产生IFN-γ，表达颗粒依赖性结核分枝杆菌杀灭活性。因此，γδT细胞是抗结核免疫动员的第一道防线，针对启动γδT细胞反应的抗原可能是研制更有效结核疫苗的有利靶点。

三、结核分枝杆菌感染与细胞因子调控

结核分枝杆菌的免疫主要是由T淋巴细胞所介导的细胞免疫反应。结核杆菌侵入机体后引起炎症反应，细菌与机体抵抗力（免疫力）之间的较量互有消长，可使病变过程变得十分复杂。病原体与宿主之间的相互作用决定了感染性疾病是否发生和病程的转归。虽然，有关结核杆菌（抗原）、巨噬细胞、淋巴细胞相互作用的分子水平的具体细节，现在还不是很清楚，但是，细胞因子的质或量的改变，或者细胞因子信号转导途径的改变，均可影响宿主对结核的免疫。细胞因子与细胞表面相应受体结合，激活或抑制淋巴细胞及抗原递呈细胞以及对于促进细胞迁移，诱导其他细胞因子的转录，促使多种淋巴因子的释放，作为免疫调节剂上调T细胞和抗原呈递功能等方面都有重要作用。

1. γ-干扰素（IFN-γ）

IFN-γ是控制结核分枝杆菌感染的一种关键性的细胞因子，主要由激活的CD4^＋T和CD8^＋T细胞以及NK细胞产生。IFN-γ可以诱导Th0细胞向Thl细胞分化；活化更多的效应细胞和细胞毒性T细胞（CTL），这些细胞对于杀死或抑制结核分枝杆菌是非常重要的。MHC分子可以通过增加抗原递呈来刺激IFN-γ的产生，除以上这些作用外，IFN-γ可以增加巨噬细胞清除结核分枝杆菌的活性，是最主要的激活巨噬细胞产生抵抗细胞内病原体的因子。研究表明，缺乏IFN-γ基因的小鼠，感染小剂量的结核分枝杆菌后，不能够产生活性氮介质，也不能够限制结核分枝杆菌的生长，可引起广泛组织破坏及坏死，致使结核分枝杆菌大量繁殖。同时，缺乏IFN-γ受体基因的小鼠，接种BCG后，出现致死性BCG感染，这说明IFN-γ在控制结核分枝杆菌感染方面具有重要的作用。

2.白介素-12（IL-12）

IL-12又名NK细胞刺激因子，是一种相对分子量为70kDa的异源性细胞因子，主要由激活的T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞和单核细胞产生。具有促进CTL成熟，诱导Th1型细胞分化，刺激T细胞和NK细胞释放IFN-γ，抑制IL-4的产生，调节Th1型细胞因子和Th2型细胞因子之间的平衡的作用。研究发现，IL-12的缺乏导致结核分枝杆菌易感性增加；反之，如果用IL-12治疗患者，可以显著减少结核分枝杆菌的数量。

3.肿瘤坏死因子（TNF-α）

TNF-α是机体启动炎症反应的关键细胞因子，在宿主的免疫反应中起到很重要的作用。结核分枝杆菌可以诱导巨噬细胞、树突状细胞和T细胞分泌TNF-α，并于IFN-γ共同促进肉芽肿的形成，对机体包围感染部位防止扩散起到很重要的作用。在结核分枝杆菌感染中，T细胞和巨噬细胞分泌的TNF-α在诱导炎性细胞因子的保护性免疫反应以及提高生存率方面发挥不同的作用。另外的研究表明，TNF-αRP55缺陷的小鼠不能中和TNF-α，感染结核病后会导致致死性的肉芽肿坏死。所以，虽然TNF-α在宿主抵抗结核分枝杆菌入侵中起着关键作用，但过量的TNF-α在结核分枝杆菌感染中也参与免疫病理，造成组织坏死。研究人员发现，TNF-α能够通过自分泌和旁分泌的方式上调基质金属蛋白酶9的分泌，后者会对组织造成破坏。近来，有人发现结核病人巨噬细胞产生的TNF-α能够增加结核分枝杆菌细胞内的繁殖。由此可以看出，TNF-α也有它反方面的作用，在抗结核免疫中，具有两面性。

4.白介素-6（IL-6）

IL-6是B细胞刺激因子，也能够激活巨噬细胞；它不仅仅由T细胞产生，而且也可由巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞等以及其他非淋巴系统细胞产生。无论是在急性还是慢性结核分枝杆菌感染中，它都能提供一种非T细胞依赖性的抗结核分枝杆菌感染方式。IL-6可以作用于B细胞和肝细胞，杂交瘤细胞、浆细胞等多种细胞，并通过它的促炎症反应活性和对其他细胞因子产生的影响来增加机体的抵抗力。和其他的Th2型细胞因子不同，在结核分枝杆菌感染中，IL-6不仅为分泌IFN-γ的T细胞的激活所必需，而且是一种主要的诱导保护性T细胞的分子，起着加强IFN-γ的作用。国外研究发现，感染结核分枝杆菌后，与野生型的对照组小鼠相比，IL-6在有缺陷的小鼠体内IFN-γ产生减少并且寿命减短。虽然，很多研究发现IL-6有诱导抗结核分枝杆菌感染的保护性免疫反应，但是也有报道说IL-6有抑制巨噬细胞对IFN-γ的反应性的不良作用。

5.诱导型一氧化氮酶（iNOS）

诱导型一氧化氮酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）在巨噬细胞介导的宿主防御反应中具有重要的作用，因为iNOS可以催化巨噬细胞中的L-精氨酸产生NO和活性氮介质，激活巨噬细胞杀灭胞内细菌。研究结果显示，活化的小鼠巨噬细胞产生的NO能有效杀死致病的结核分枝杆菌。在炎症应答反应中，i-NOS诱导产生的NO，大部分来自炎性细胞，如巨噬细胞。

四、树突状细胞与结核分枝杆菌相互作用的研究

机体对结核分枝杆菌产生细胞免疫反应必须由抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）介导。抗原呈递是产生有效细胞免疫应答所必需的。巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）是重要的抗原递呈细胞。 DC是人体内抗原呈递功能最强的、唯一能激活幼稚T淋巴细胞的专职抗原递呈细胞。DC最初是Steinman和Cohn等在1973年从小鼠脾组织中分离发现的，因其形状具有树突样或伪足样突起而命名。

DC在体内含量很少却分布广泛，具有刺激初始T细胞和激活固有免疫反应的独特功能。根据明显的谱系和细胞表型不同，分为骨髓DC和淋巴DC两大类，均起源于体内多能造血干细胞。根据刺激T细胞增殖能力的不同，又分为未成熟DC和成熟DC，未成熟DC主要分布于非淋巴组织，如肝、肾、心和皮肤等；成熟DC则分布在淋巴组织，如脾和淋巴结等。未成熟DCs（iDCs）表面MHC-II分子和共刺激分子（CD40、CD80、CD86）的表达相对比较低，刺激T细胞活化增殖的能力也比较弱，但具有很强的识别和捕获抗原的能力，在感染和炎症刺激作用下，iDCs借助表面TLRs、肿瘤坏死因子受体（TNFR）和其他模式识别受体（PRRs）捕获抗原并经历成熟过程，降低或失去捕获抗原的能力，使得表面的MHC-II类分子表达上调和共刺激分子的表达，并在趋化因子的作用下，定向迁移到淋巴结。在淋巴结中，成熟DCs通过向T淋巴细胞递呈抗原并提供共刺激信号，可有效启动Th1或Th2反应。因此，DC主要牵涉诱导T细胞介导抗结核分枝杆菌的免疫反应，而巨噬细胞诱导前炎性因子介导炎症反应。

结核分枝杆菌感染巨噬细胞后，其分泌蛋白激活巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞分泌TNF-α和组织胺，促进炎症反应和肉芽肿的形成，是限制结核传播所必需的。结核分枝杆菌分泌蛋白也诱导树突细胞的成熟和分化，刺激T细胞产生IFN-γ，同时能够和IFN-γ共同刺激非炎性巨噬细胞产生活性NO和B7.1分子表达上调，杀灭或清除结核分枝杆菌。此外，成熟的树突状细胞吞噬结核分枝杆菌以后，刺激特异性T细胞产生低剂量的IFN-γ和高剂量的IL-10，低剂量的IFN-γ不能激活巨噬细胞产生活性NO，加上IL-10又抑制巨噬细胞产生NO，所以巨噬细胞不能产生活性NO和B7.1分子表达下调，促使结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。分泌性蛋白刺激巨噬细胞连续释放TNF-α和炎症物质破坏自身组织。研究表明，虽然活化的DCs可抑制结核分枝杆菌的繁殖，但是无法杀灭细菌。结核分枝杆菌在DCs内的滞留或繁殖，可以刺激T细胞活化，最终促进肉芽肿的形成和持续感染。DCs为分枝杆菌提供了一个潜伏的场所。

Bhattk等采用追踪鼠DC和巨噬细胞群迁移的不同途径来分析对结核分枝杆菌早期获得性免疫的诱导，结果显示，结核分枝杆菌能够刺激DC正反馈调节趋化因子受体7（chemokine receptor 7，CCR7）的表达，并特异迁移到引流淋巴结（DraininglympHnode，DLNs）。而且，结核分枝杆菌只在DLNs处，调节DC诱导Th1反应。用结核分枝杆菌感染猕猴，结果发现，DC迁移到DLNs或T细胞运输到感染部位能改变结核分枝杆菌感染的结果，即形成潜伏感染或发展成活动性TB。同时还发现，在感染部位能够快速提高DC的数量，活化DC并产生关键的细胞因子，诱导最强的保护性T细胞反应。

DC的免疫调节作用，是通过DC正负调控表面诸多受体分子来实现的，如模式识别受体（天然免疫受体）的C型凝集素（CLR）和Toll样受体（TLR）。DC-SIGN（DC-sepecific ICAM-grabbing non-integrin）是DC的CLR主要成员和多功能免疫分子，在DC上述免疫调节中起重要作用。 DC-SIGN又称CD209，是美国科学家在研究人类免疫缺陷病毒（HIV）感染机制中发现的。由于该C型凝集素能够介导DC与初始T细胞表面的ICAM-3结合而无需整合素，但必须有Ca^2＋参与，故而被命名为DC-SIGN。DC-SIGN在体内主要表达于外周组织中未成熟DC以及淋巴组织中成熟DC表面，而在粒细胞、T细胞及活化T细胞、B细胞及活化B细胞、单核细胞及活化单核细胞、胸腺细胞以及CD34^＋骨髓细胞中均不表达。

最近的研究表明，DC-SIGN可在DC黏附迁移及炎症反应、激活初始T细胞及启动免疫应答，以及病原体与肿瘤的免疫逃逸等诸多方面发挥重要作用，是DC介导调控天然免疫与获得性免疫反应的分子基础。 DC通过DC-SIGN识别及捕获和内化结核分枝杆菌，然后进入溶酶体区，形成含有结核分枝杆菌的吞噬小体，并在DC内成熟为溶酶体，最终导致结核分枝杆菌的降解，随后由DC释放出被降解的结核分枝杆菌胞壁成分ManLAM，后者可再通过DC-SIGN和TLR介导免疫抑制。此外，DC也可通过甘露糖受体捕获和内化分枝杆菌胞壁的另一成分AraLAM，由溶酶体降解后通过CD1b分子将其递呈给T细胞。研究发现，ManLAM可通过DC-SIGN干预TLR4参与LPS诱导的DC成熟，以及抗炎细胞因子IL-10产生，由此使免疫活化转向免疫抑制状态，促使结核分枝杆菌在DC中存活。

当外源性抗原进入机体后，很快（数分钟）就会被APC在感染或炎症局部摄取，然后在细胞内降解抗原并将其加工处理成抗原多肽片段，再以抗原肽-MHC复合物的形式表达于细胞表面（此过程称为抗原处理，约需3小时）。当APC与T细胞接触时，抗原肽-MHC复合物被T细胞的受体识别，从而将信息传递给T细胞，引起T细胞活化（此过程称为抗原递呈）。活化的T细胞通过分泌淋巴因子来进一步活化B细胞以产生抗体或活化其他T细胞以引起细胞免疫反应。可以说，抗原识别过程实质上是携带抗原肽-MHC复合物的APC “寻找”抗原特异性初始T细胞的过程；初始T细胞多由树突状细胞活化，效应T细胞和记忆细胞识别多种APC递呈的抗原。

近年有报道称，发现T细胞攻击的主要是分枝杆菌中的一种热休克蛋白（heat shock protein, HSP）。HSP是一种具有高度保守性的蛋白质，从原核细胞到动植物中均有，其氨基酸顺序有50%同源。在正常生物中含量极少，但在感染、发热、细胞恶变等外界环境条件改变时即大量产生，故HSP又称应激蛋白。HSP在许多病原菌中均有，其氨基酸序列有共同成分，不同细菌引起的亚临床感染均可引起一定程度相同的免疫，被认为是非特异性免疫。