牛结核病发病机理的研究进展

第五节　牛结核病发病机理的研究进展

一、结核分枝杆菌感染宿主细胞的生物学过程

结核分枝杆菌是典型的胞内寄生菌，在感染早期，最先入侵的宿主细胞主要是肺泡巨噬细胞。

细胞介导的免疫反应是主要的免疫保护机制。 Dannenberg等将结核杆菌感染引起的宿主反应过程分为为三个阶段，即起始期、T细胞反应期和共生期以及细胞外增殖和播散期。

1.起始期

是肺泡巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌的初级阶段。通过气溶胶吸入的结核分枝杆菌被肺泡巨噬细胞吞噬，结核分枝杆菌在肺泡巨噬细胞内是存活繁殖还是被杀灭，取决于宿主巨噬细胞与被吞噬细菌的相互作用，这一过程有许多细节尚不清楚。

2. T细胞反应期和共生期

这一时期带有结核分枝杆菌的抗原呈递细胞（APC）激活特异性T淋巴细胞反应。Tc细胞使已经吞噬结核分枝杆菌的巨噬细胞死亡而释放结核杆菌，而Th细胞则能聚集和激活新的单核细胞或巨噬细胞到达病灶部位。有T淋巴细胞介导的细胞免疫反应和迟发性变态反应在此期形成，对结核分枝杆菌的发病、演变及转归产生决定性的影响，肉芽肿的形成可以防止结核分枝杆菌进一步扩散。此时，宿主产生免疫应答反应，而结核分枝杆菌仍持续存活，在临床并不引起发病（共生期）。

3.细胞外增殖和播散期

含有具有生长能力，但不繁殖的结核分枝杆菌的固体干酩灶一旦液化，细菌便可大量增殖并突破宿主细胞局部的免疫防御机制，引起播散。当结核分枝杆菌入侵宿主机体后，从感染、发病到转归与多数细菌感染性疾病有显著不同，宿主反应在结核病发病学上的作用较其他感染性疾病更为重要。因此，掌握结核杆菌感染的生物学过程，对控制结核杆菌具有重要的意义。

二、结核分枝杆菌与巨噬细胞的相互作用

结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌，它在机体内的主要宿主细胞是巨噬细胞。当结核分枝杆菌侵入机体后，首先遇到非特异性免疫机能的抵抗，主要引起以巨噬细胞为主的细胞吞噬和炎症反应；而在特异性防御机制中，需要巨噬细胞对所吞噬的结核分枝杆菌进行抗原加工处理，以MHC-短肽的形式附着于巨噬细胞表面并进一步呈递给T细胞，引起机体的特异性免疫反应。T细胞产生的细胞因子又能吸引和激活巨噬细胞，被激活的巨噬细胞杀菌能力增强是非特异性的。在结核病中，被激活的巨噬细胞不仅对结核杆菌，而且对其他细菌的作用也增强。

1.结核分枝杆菌被巨噬细胞吞噬的生物学过程及其存活机制

肺泡巨噬细胞内，溶酶体具有直接杀菌功能，溶酶体是胞吞作用中由液泡组成的细胞器复合体。在溶酶体的液泡里有许多水解酶可以降解包括微生物在内的所有大分子物质。这些酶能在溶酶体的酸性内环境中发挥作用。同时，溶酶体也是动物细胞中酸性最高的细胞器，其pH值可达4.5～5.0，细胞膜上ATP介导的质子泵，即液泡H^＋-ATP酶不断维持着这种酸性环境。吞噬体是通过对包括微生物在内的大分子物质的吞噬作用而形成的，它能与溶酶体相互融合。在一定条件下，巨噬细胞的吞噬体能与溶酶体融合，吞噬细胞溶酶体的形成是一个充满活力的过程，在这个过程中，吞噬体不断成熟、分裂，并与胞吞的细胞器相互融合。借助于吞噬溶酶体的融合作用，被吞噬的微生物被溶酶体内的酸性水解酶降解。这个生物学过程受到细胞内各个分子的高度调控，是巨噬细胞重要的抗菌机制。吞噬溶酶体的融合是机体有效杀灭结核分枝杆菌的重要机制，溶酶体水解酶的降解作用和溶酶体的直接和间接的酸化作用，在一定程度上反映了吞噬溶酶体的抗菌活力。

巨噬细胞表面存在几种介导抗原摄取的表面受体，利于结核分枝杆菌的侵入，存在于巨噬细胞表面的胆固醇可作为结核分枝杆菌细胞表面的锚定部位，结核分枝杆菌通过与细胞膜上胆固醇结合而锚定于细胞表面，在巨噬细胞膜表面由于存在许多种抗原受体，结核分枝杆菌能与这些受体结合，通过受体介导的内吞进入巨噬细胞内。结核分枝杆菌由何种受体作用介导的内吞决定了结核分枝杆菌随后在巨噬细胞内的命运，由免疫球蛋白受体FcRs和Toll样受体介导的内吞触发宿主防御反应机制，而由补体受体介导则促进结核分枝杆菌在吞噬体的存活。

结核分枝杆菌进入巨噬细胞后，或者被巨噬细胞内的杀菌物质清除，或者是在巨噬细胞中存活下来。一方面，结核分枝杆菌与巨噬细胞膜表面受体结合后，经过膜内陷形成吞噬小体进入细胞内与溶酶体融合，溶酶体内容物如蛋白水解酶和其他杀菌物质释放到吞噬体内，导致吞噬体酸化，以适应消化酶发挥活性的需要，从而清除入侵的细菌；另一方面，结核分枝杆菌能在吞噬小体内存活，一般吞噬小体对许多微生物都有杀灭作用，而结核分枝杆菌能通过抑制存在于吞噬小体膜上的囊泡ATP依赖性质子泵的功能，抑制吞噬小体酸化，从而阻止吞噬小体与溶酶体融合，使吞噬小体滞留于早期成熟阶段，在早期吞噬小体内生存下来。这种存在于内吞体内的结核分枝杆菌能摄取其生存所必需的铁元素。铁也是许多宿主防御反应不可缺少的，为了成功地与宿主竞争铁离子，结核分枝杆菌具有特化的铁离子捕获分子。当然，结核分枝杆菌阻滞吞噬小体成熟并不是完全性的，有些含结核分枝杆菌的吞噬小体，仍能向成熟阶段发展，以致被巨噬细胞降解清除。此外，巨噬细胞的杀菌机理并不局限于溶酶体以及过氧化氢和其相关的杀菌物质上，最近的研究表明，巨噬细胞中一氧化氮和精氨酸的氧化氮代谢产物也具有杀菌作用。

虽然巨噬细胞具有杀菌功能，但是这种非特异性的杀菌作用是不完全的，对于部分结核杆菌而言，它还有一系列的措施，如抑制巨噬细胞的激活、消除氧化基团、抑制细胞溶酶体与吞噬体的融合并抵抗溶酶体酶的作用，可以有效地逃避巨噬细胞吞噬成为胞内寄生菌，并将巨噬细胞作为在体内存活甚至长期存在和生长的“居留地” 。

2.结核分枝杆菌感染对巨噬细胞信号转导的影响

结核杆菌与巨噬细胞的相互作用，导致宿主细胞的信号转导和生理功能发生改变，集中研究宿主细胞与病原体的相互作用，有益于研究胞内致病菌的发病机理。早在30年前，Armstrong和Hart就确定结核杆菌存在于巨噬细胞的吞噬溶酶体中，结核杆菌诱导抑制吞噬体与溶酶体的融合是结核杆菌发病机理的重要特征，假如细菌能够消除先天免疫系统的直接抗菌活性，那么有效的抗原呈递和获得性免疫也一样有效。吞噬体成熟为吞噬溶酶体是巨噬细胞和吞噬性粒细胞的先天免疫防御机制。结核分枝杆菌抑制吞噬体成熟的正常途径和它的调节机制，值得我们关注。研究表明，巨噬细胞在吞噬的时候，细胞质中的Ca^2＋的浓度由正常的50～100nm上升到500～1000nm。虽然，Ca^2＋信号不是巨噬细胞吞噬时必须的，但是，在先天免疫应答中，它是几个级联反应所必须的，包括活性氧的产生和吞噬体成熟为吞噬溶酶体等。此外，有实验结果表明，在巨噬细胞中，吞噬体成熟为吞噬溶酶体，Ca^2＋信号是必须的。用有毒力的活结核分枝杆菌感染人的巨噬细胞，结果不引起细胞质中Ca^2＋的浓度增加，用灭活的结核分枝杆菌感染人的巨噬细胞，结果使细胞质中Ca^2＋的浓度增加，并且吞噬体可以成熟为吞噬溶酶体。如果添加Ca^2＋的高亲和力的螯合剂，结果发现用灭活的结核杆菌和其他颗粒刺激巨噬细胞，其吞噬体也不能成熟为吞噬溶酶体。由此说明，在正常条件下，巨噬细胞的杀菌活性是通过钙离子信号转导实现的。活的结核分枝杆菌与巨噬细胞相互作用，抑制巨噬细胞的Ca^2＋信号转导是与结核杆菌的致病机理相关联的。

巨噬细胞的杀菌活性是通过钙离子信号转导实现的，灭活的结核分枝杆菌首先结合巨噬细胞表面的受体诱导激活宿主细胞的鞘氨基醇激酶（sphingosine kinase，SK），鞘氨基醇激酶催化鞘氨基醇磷酸化产生1-磷酸-鞘氨醇（S1P）。鞘氨基醇激酶的激活是由蛋白质酪氨酸激酶（protein tyrosinekinases，PTKs）介导的。 S1P是具有生物活性的类质，是第二信使分子，它诱导细胞质中内质网储存的Ca^2＋释放。细胞质中，吞噬体周围区域Ca^2＋浓度的提高导致吞噬体成熟为吞噬溶酶体。相反，活的结核分枝杆菌抑制巨噬细胞鞘氨基醇激酶的激活和吞噬体的成熟。1-磷酸-鞘氨醇（S1P）的产生减少，使Ca^2＋浓度降低，使吞噬体成熟受到抑制，导致结核分枝杆菌在细胞中存活。细胞质中Ca₂＋的升高，使得Ca^2＋与钙调蛋白结合，形成Ca^2＋-CaM复合物，促使吞噬体膜发生变化。钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ（Ca^2＋/CaM-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ），作为Ca^2＋信号转导的关键因子，能够调节细胞多种功能。早期内涵体抗原1（Early endosomal antigen-1，EEA-1）调整小囊泡的融合，结合三磷酸磷脂酰肌醇（PI3-P）促使溶酶体成熟为具有杀菌作用的酸性吞噬溶酶体。相反，活的结核分枝杆菌通过抑制Ca^2＋信号阻滞细胞质中的CaM吞噬体的成熟，促进结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。研究发现，活的结核分枝杆菌可以抑制晚期溶酶体对吞噬泡溶解作用，并通过水解三磷酸磷脂酰肌醇（PI3-P）抑制吞噬溶酶体的成熟；三磷酸磷脂酰肌醇是细胞膜上一种调节运输的脂类，对于溶酶体内的物质获取吞噬泡是很重要的。Vergne等发现，LAM通过抑制Ca^2＋释放，下调Ca^2＋／Calmodulin PI3K hVPS34级联反应，干扰吞噬体内PI3P产生，阻断吞噬体成熟,使Mtb能长期定居于胞内，并与巨噬细胞内有杀菌和抗原加工功能的细胞器相隔离。若用ATP处理巨噬细胞，可有效诱导Ca^2＋依赖性吞噬体—溶酶体融合，从而杀伤胞内结核分枝杆菌。此外，上述Ca^2＋释放抑制还可能与IL-8分泌抑制相关，如此可削弱结核分枝杆菌感染局部的炎症反应，有利于结核分枝杆菌生存。