结核病的分子流行病学

第二十章　结核病的分子流行病学

结核分枝杆菌是造成世界各国公共卫生方面巨大损失的一种病原菌，1/2～1/3的世界人口受到过结核分枝杆菌的感染。每年约有800万人患活动性结核疾病，其中有300万人死亡，这样就使结核病成为由单一感染因子造成死亡的主要病因。结核病也是HIV感染个体的第一号杀手，因为结核病可以累及人们一生中的生产工作时期，故其造成的经济损失是巨大的。

在结核病研究中的一项主要进展为应用分子生物学方法鉴定和追踪结核分枝杆菌的特异性菌株。起初的基因型分型技术多不易进行或难以用作比较，因而使用价值有限。IS6110的鉴定使结核病的流行病学进入了一个新的时代。IS6110是一种基于相当简单的基因型分型技术的多态性重复元件。在1992～1998年间，曾有262项报告报道应用这一技术来研究结核病的发病机制，或有助于了解细菌在人群中传播的动力学。

分子流行病学研究现已开始为结核分枝杆菌不同菌株的基因型和表性特征提供新的信息。此种信息可实现使用不同种类的基因标记来研究特定的流行病学问题。与结核分枝杆菌的完整基因组序列合并使用，新的基因型分型技术有可能使特异性等位基因与表型特征相关，或鉴定出决定毒力和致病性的基因。最终，此种先进知识可促进疫苗发展的进展。提高治疗的质量，可对于耐药机制有较好的了解和减少疾病的传播。

一、分子流行病学技术

药物敏感性是首先被用作为菌株标记的表型特征。但是这一标记的应用价值有限，因为有较高比例对抗菌制剂耐药的菌株存在。早期应用分子生物学技术来鉴别结核分枝杆菌菌株的企图并不成功。应用噬菌体感染易感变异性的分型技术重复性不高，只能用以鉴定少数菌株。由限制性内切酶消化整个基因组DN A所形成DN A片段的观察结果较易于重复，并能鉴定出一定数量的细菌分离物。不过这种方法所获得的程式较为复杂，一般难以分析和比较。

自从发现了在数量和位置上有变化的重复DN A序列以后，结核病的菌株分型就发生了革命性的变化，使结核病的流行病学进入了分子水平时代。限制性内切酶消化和重复元件探测联合应用的方法易于操作，结果能重复，并可获得许多易于比较的不同程式。IS6110是研究最为深入，应用最为广泛的插入序列。其中有6个基因标记曾进行了系统的研究。最近有一结核分枝杆菌菌株的基因组已进行了全部测序，从中又鉴定出另外的32个重复元件，其中有些最后证实为有用的多态性标记。

（一）IS6110

1.IS6110限制性片段长度多态性（RF LP）分析 IS6110是Thierry等人在结核分枝杆菌染色体中发现的。它包含有1 335个碱基对，并且属于原在肠道杆菌属中发现的IS3家族插入序列（IS）。这一IS含有两个编码与转座过程有关的基因产物的功能区。IS6110只有在结核分枝杆菌复合体菌种中存在，但也有人报道存在有缺少这一元件的结核分枝杆菌菌株，IS6110的插入数目和其在结核分枝杆菌染色体中的位置在不同的分离菌株中极不恒定。此外，IS6110较易于整合至其侧翼目前称之为“热点”整合区的直接重复（DR）区域。实验室菌株的整个基因组序列分布已证实为非随机性的，较易插入基因间或非编码区域，提示插入热点可防止基因被灭活。

自1992年的一次国际会议以后，基于IS6110的RFLP即成为结核分枝杆菌基因分型的标准方法。在结核分枝杆菌基因指纹分析标准化上有3个关键性的参数，即应用PvuⅡ限制性内切酶消化DNA，以IS6110作为基因标记物和加入分子量标准以测定条带大小。此种标准化过程有利于对由世界范围内不同实验室中所分离的菌株进行比较。

2.基于IS6110的RFLP程式　基于IS6110的RFLP程式中的多态性主要来源为存在于菌株基因组中元件的拷贝数目。虽然这种拷贝数可以由0～25，但多数基于人种的分子流行病学研究报道，多数菌株的拷贝数为每一菌株8～18。世界上有许多流行暴发报道中均用IS6110作为标记，并证实有一定程度的多样性。例如Small等在旧金山对487例诊断为结核病的病人进行的研究证实有326种不同的程式。但是亚非地区的报道就与之不同，IS6110多样性明显降低。在中国香港地区、印度、马来西亚、越南和坦桑尼亚，少数菌株只有1～2个IS6110拷贝。在旧金山至今所鉴定菌株中的1%以下的菌株只有1～2个条带或全无条带。此外，在亚洲也发现有无IS6110插入序列的菌株。仅有少数IS6110拷贝的菌株间插入部位的保存，使利用这些菌株来判断流行病学意义上受到限制。在用IS6110检测只有为数极少或全无条带的地区内，尚可用辅助性的分型系统来区分只有少数拷贝的菌株，如用多态性富含GC重复序列pTBN12的指纹分析；用直接重复序列探针的次级指纹分析和直接重复序列碱基PCR。

3.IS6110的稳定性　基因标记物的一项关键性特点为其经过一定时间后的稳定性。为了便于在流行病学研究中的应用，指纹必须在超过了研究的时间后仍可辨认。然而不时也可发现足以形成基因型多样性的变化，以致流行病学上无关的分离菌株亦可有可识别的程式。变化过快的标记将使流行病学联系难以发现，而过于稳定的标记又会使原无联系者被推断为有直接的联系。

在20世纪90年代早期进行的许多研究均证实，基于IS6110的指纹在长达数月至数年的时间内一般不会发生改变。曾在体内和体外连续传代多次的结核分枝杆菌在RFLP程式上并未见有任何变化。几项研究资料表明，有一持续感染结核分枝杆菌为期4年之久的病人，其指纹分析结果并无改变。此外，多种药物耐药性（MDR）的发生与RFLP程式改变之间亦无联系。

但是，有关RFLP的临床资料逐步增加，RFLP程式经过一定时间后确可发生变化。例如，由丈夫和妻子分离的细菌分离物除了一个条带不同以外全部相同，表明这是IS6110片段插入的结果。一项有艾滋病流行条件的研究证实，在11例病人中有一例病人出现了附加的条带。另一研究中的18例病人中的1例持续培养阳性结核病人的细菌性指纹有改变，曾经在各种培养基上传代1 400次达50年之久的分枝杆菌菌株卡介苗（BCG）在27子代菌株中有3例出现程式改变。

4.次极RF LP标记物　结核分枝杆菌是一种不发生基因重组的克隆微生物，但多可垂直通过突变和基因重排使变异性集累。结核分枝杆菌的这种克隆性使临床细菌分离物之间的基因型的比较成为可能。实验资料表明，如果结核分枝杆菌的IS6110杂交条带少于5条，则结核病人间流行病学联系上的可行性不大。辅助性标记物的应用将可使基因分型和流行病学研究间的相关性加强。

因为IS6110程式可因时间的延长而发生改变，所以有些流行病学相关的菌株只表现轻微不同的程式。因此，用一次级标记物进行基因分型，以确定在一具有5拷贝的IS6110菌株感染者与具有几乎相同指纹的个体之间是否发生传播是很有必要的。如果次级分型相配，则提示传播已发生。在此情况下如不进行辅助性分型，则必将低估在特定社团中结核分枝杆菌传播的可能性。但是在大量研究中，次级分型的工作量较大，故有人提出，如果具有6个以上拷贝的菌株仅有1～2条条带不同，则可将彼等视为一组的细菌。

（二）IS1081

IS1081是Collins在克隆牛型分枝杆菌特异性DN A序列时发现的。它是除外IS6110的另一存在于结核分枝杆菌中的可转座的元件。这一插入序列在所有结核分枝杆菌复合体菌种中都可发现，且其在结核分枝杆菌的不同菌株中的分布是均一的，常有5～7个拷贝存在于相同的部位。因此，它在区别结核分枝杆菌的不同菌株方面并非有用的标记物，只是可用以鉴别BCG和结核分枝杆菌。

（三）主要多态性串联重复

主要多态性串联重复（MPTR）可在结核分枝杆菌复合体及其他分枝杆菌中发现。通过自身杂交实验得知，这一序列是结核分枝杆菌中的主要重复DN A，并组成PE和PPE多基因家族。而且一般认为MPTR序列在基因重排和基因调节中起作用，因为这一序列与大肠埃希菌重复性基因外回文序列及重组信号部分同源。MPTR不能用作常规菌株鉴定，因为在结核分枝杆菌基因组内有100多个此种元件存在，因而使指纹难以辨识。

（四）多态性富含GC重复序列

存在于重组质粒TBN12中的多态性富含GC重复序列（PGRS）是一种小型但为染色体内多种聚集物，并且在每一染色体内含有数百个拷贝的许多不完全重复体，也不仅限于在结核分枝杆菌复合体的菌种内发现。PGRS的宿主范围尚包括M.kansasii和K.szulgae。产生PGRS相关性多态性的机制尚不清楚，但有人在检查了结核分枝杆菌基因组后提出，这一元件可编码一类能产生抗原变异性的蛋白质。有些研究中应用PGRS分型可减少聚集的程度和增加识别流行病学联系的可能性。

（五）基于PCR的分型方法

RFLP分型方法较烦，需要有感染分枝杆菌的培养和大量的DN A。且须数周方可获得结果。基于PCR的方法则只需极少量的DN A，因而不需要进行细菌培养即可获得。理论上PCR分型法可用于临床标本的直接检查，此时正在进行常规的接触追踪。也有人报告利用基于PCR的方法在疾病流行时直接由痰液标本中同时进行结核分枝杆菌的鉴定和菌株分型。

一般而言，有很多基于PCR的方法可供在结核病分子流行病学领域中使用。但至今尚无可供大范围研究中应用并产生可重复结果的标准化PCR方法。现简述其中较为常用的两种方法。

1.直接重复（DR）序列（Spoligotyping）　DR序列包含有为非重复性DNA所隔开的36bp，每一片段的长度为36～41bp。多数的结核分枝杆菌在基因组中的含有DR区域内至少有一个IS6110元件。长短不一的间隔区（DRS）带有多态性。这一技术中尚涉及DR位点的PCR扩增。故这一分型方法可通过分析单一位点而区分结核分枝杆菌菌株。基于PCR的指纹分析的应用已证实是可在此区域中使用的，因为在染色体内的相当小的一部分内存有多态性。

这种方法在鉴别只有很少IS6110条带的结核分枝杆菌菌株时甚有帮助。用此方法对分枝杆菌的非典型菌株的检测结果并未显示这一技术对于结核分枝杆菌的特异性。对痰液标本直接检测DR的方法使其能在一些急性临床状况下应用。此种次级标级的另一优点是其操作经济易行，是结核分枝杆菌复合体分型的快速方法。这些特点使其亦可在较不发达的国家内使用。

2.混合接头PCR　混合接头PCR是RFLP分型中的一种快速技术，这种方法系用一种对IS6110特异的引物和另一连接于限制性基因组DNA接头互补的次级引物。接头在其一链中以尿嘧啶替代胸苷，并通过尿嘧啶N－糖基化酶的作用消除此链而得以发生特异性扩增。这种方法产生类似Southern印迹法中的条带程式，并已成功地在结核分枝杆菌复合体培养分离物的鉴定和结核分枝杆菌IS6110插入部位分布研究应用。这一技术也可成功地应用于鉴定在12个流行发生时多种药物耐药菌株的鉴定。

二、结核病分子流行病学的应用

分子流行病学分型方法的选择取决于不同的情况。在疾病传播已形成多时的大型流行病学研究中以使用分子钟较慢的插入序列为好。在传播正在进行或为近期发生的传播情况下，具有快速变化分子钟的插入序列较为有用。如果基因型变化太快，则可因遗失了有联系的菌株而低估传播。若基因型变化太慢，则可将无关的菌株联系起来，这样必将高估传播。因此在区分近期传播与远期传播的情况下，以用快速分子钟的基因型为宜；短分子钟的基因型不能用以区分远期和近期传播。大城市之类的区域中常可出现远期和近期传播共存的情况，此时就应当以快速和缓慢分子钟的基于IS技术的合并应用为宜。在进行结核病的全球性追踪及进化研究时则应当用可靠的缓慢分子钟的插入序列。

（一）人群传播动力学

RFLP分型研究在了解社团中结核病传播动力学上甚为有用。这些研究的基本前提是凡是由相同指纹的菌株所感染的病人应视为在流行病学上有联系，或称之为“成群病例”，而且是新近感染的。而由具有特殊RFLP程式分离物所感染的病人，则代表在不同时间和地点情况下所获得菌株的复活。

基于人群的分子流行病学在特定社团中对于结核病控制的精确了解是很有益的。在旧金山、纽约和阿姆斯特丹进行的研究证实了有关结核病控制措施上相似而有意义的重要发现。在这3个社团中的新近感染较之常规流行病学所估定的10%为高。在旧金山，近1/3的结核病新病人均为新近感染的结果；而在纽约，据估计成群病例约占40%；在阿姆斯特丹则为47%。在这3项研究中都存在有常见的危险因素，诸如低社会经济群体、少数民族和艾滋病。在旧金山有一病人已被证实为指示病例，因其是引起1991～1992年旧金山结核病新病人传播的元凶。在阿姆斯特丹的一般性接触追踪仅鉴定出5.6%的病例。

这些研究归于结核病的控制有其重要的意义。当证实了正在进行的感染传播在疾病中的负担远较以往所认为的为高（28%～40%），从而强调了控制措施在判断传播中的重要性。这些研究也证实了一般的接触追踪只能鉴定出一小部分的传播（特别是在边缘地区），强调利用新方法进性研究的必要性。将这些结果推断至其他环境的情况证实，在某一社团中所获知的有关结核病传播动力学知识，已可在其他相似的社团中应用。以增强对于结核病的控制。

（二）流行病学可疑传播的证实

RFLP目前已在结核病的可疑流行暴发中用作为研究工具。许多国家中的不同集团内都已进行了多项研究，如医院、监狱、收容所和街道。此种形式研究能提供常规流行病学所不能获得的信息和现代结核病学的新的知识。

一项早期研究证实结核病可在HIV感染者中播散的可能性。在有HIV感染者居住条件下用常规的监视方法检出12例结核病，其中用RFLP分析证实最先发现的2例不是流行的来源，并发现在HIV感染的病人中新近获得结核病的快速发展。这一研究促使美国卫生防疫机构加强对于结核分枝杆菌病人的更为严格的隔离。在诸如医院、监狱、学校和流浪汉收容所等处适当加强诊断和治疗的监管，目前已使结核病的传播有了明显的减少。

分子流行病学也可用以证实H IV病人中的M DR结核病的流行。16个病人中有15个病人的结核分枝杆菌DN A指纹相同。这些病人都是与MDR结核病病人住在同一病房，且较对照病人更靠近MDR结核病人。此种以及其他类似研究结果导致了更为严格的感染控制措施的施行，特别在有许多H IV者存在的地区。

（三）再次感染的确定

几十年来一直就怀疑在过去曾感染某一菌株的个体为另一不同菌株再次感染的可能性。这种情况是在一所流浪汉收容所的流行中利用流行菌株的异常抗菌敏感性程式作为指标而发现的。但是直到有了分子指纹技术以后，再次感染才得到证实。在纽约市立医院的反复多次结核分枝杆菌培养为阳性的HIV感染病人中，有11个病例的连续细菌分离物对抗菌制剂耐药，其中有6个病例虽然产生了耐药性，但其RFLP程式基本上无改变，表明已获得了耐药性。在另外的5个病例中，细菌分离物的RFLP程式在耐药性被检出之际发生了显著的改变。其中有一病例的RFLP程式变化应归咎于实验室操作时的污染。另有4个病例的临床和微生物学发现均与存在由一新的结核分枝杆菌引起的活动性结核的事实相一致的。由此可见，HIV感染者为MGR结核的新菌株外源性再次感染已可得到充分地证实。此外，免疫抑制状况为糖尿病者的外源性再次感染也得到证实。

非洲进行的小型研究证实了在确定鉴别诊断时确认有结核病过去病史病人中再次感染的重要性。在此研究中有5个已知HIV阳性并有结核复发的病人，对其原始和复发的结核菌分离物都已进行分析。在一个病人中证实了再次感染，其原始和复发细菌分离物表现有截然不同的指纹。而在其他4个病人中，原始和复发细菌分离物的指纹相同。

再次感染而不仅是复发的可能性。可以预期在结核病和艾滋病发病率高的国家或地区内，再次感染的发生频率也必然较高。高频率再次感染的发生对地方病流行区内的结核病控制和新的治疗措施都有重要的意义，因为再次感染将使错误地评估治疗失败的情况增多。

在香港地区进行的少量RFLP研究报告，有88%的复发病人分离物与其治疗前者相匹配，表明结核分枝杆菌的再次感染率为12%。在印度的相似研究报告中，复发病例分离物与其治疗前分离物相匹配者仅为69%，表明再次感染的发生率为31%。在发病率高的国家内进行大量人群的研究以确定再次感染的发生率，能给了解有关疫苗发展、结核病控制和化学预防等重要问题提供线索，因为在再次感染发生率高的地区内常用疫苗或化学预防一般是难以有收效的。

（四）结核分枝杆菌的污染

对于临床医生而言，实验室中的交叉污染是一个很有意义的问题，因为它可招致不必要的治疗和对病人的潜在性药物毒性作用。实验室污染可发生于用针头处理痰液标本或在转运黏液溶液时溅落所致。在一项研究中之所以怀疑到有污染发生的原因是发现7个病人的痰液标本同时为结核分枝杆菌阳性，而且都有相同和异常抗生素敏感性程式。其中有一病人表现有MDR结核病的临床表现，而其他6个病人则不表现为临床结核。所有7个病人的痰液标本都是同一天在分枝杆菌实验室中处理的，指纹分析结果证实了可疑的实验室污染。

实验室中的污染主要取决于处理标本的方式。污染的发生主要有两种方式：一种方式是在处理痰液标本时将一标本携入另一标本。BACTEC系统中标本针头热力灭菌不当也是污染发生的主要来源。无结核病的临床表现病人的直接涂片阳性，正在进行治疗病人药物敏感性程式的改变以及不可解释的培养阳性都应当考虑到交叉污染存在的可能性。在这些病例中进行及时的分子生物学分析在避免不必要的治疗方面极为有用。

三、现代流行病学应用

（一）接触追踪的预期值

发达国家中结核病控制程序的主要活动为通过对已知与感染性结核病人接触过的个体的评估而主动地搜索结核病。这一策略的基本前提是这类人群很有可能是为有感染性病例所感染，并且因而带有与指示病例相同的菌株（对药物易感性的程式亦相同）。此种设想曾在旧金山的一项比较指示病例和接触病例的DNA指纹对研究中加以检定。结果发现30%（16/54）的指纹对有不同的指纹程式，表明接触者实际上是受染于尚未鉴定出的第三者。具有较高的结核病发病率背景的人群，如移民中无关的感染较为常见；指纹相同的所有细菌分离物都有相同的药物敏感性结果。43%（7/16）的不相配指纹对表现不同的药物敏感性。这就证明接触结核病者一般是受到相同菌株的感染。但是由于有不同药物敏感性的不同菌株的存在，对于接触资料的判断应当慎重，特别是对结核病发病率高的人群。

（二）涂片阴性病人在结核病流行中的作用

一般认为痰液标本镜检未发现抗酸菌（A FB痰阴性）的结核病人较之涂片阳性者的感染性为低。根据这一设定，发达国家医院中往往因抗酸菌涂片3次阴性而将病人解除隔离。最近在旧金山进行了一项关于确定A FB涂片阴性者的感染性及其在结核病流行播散上作用的基于人群的分子流行病学研究结果显示，AFB涂片阴性病人具有感染性者仅占涂片阳性者的1/4，而且最少也可决定这一城市结核病传播的21%。这些发现在医院感染控制上有其重要的意义，诸如“A FB涂片阴性者无感染性”之类的简单常规是不正确的，甚至是相当危险的。因为A FB涂片阴性者仍占结核病传播的1/5，所以在城市中对致力于A FB涂片阴性结核病的鉴定和治疗应当予以足够的认识，必将有利于减少结核病的传播。

（三）移民对于结核病传播的影响

在当今国际间人口流动增加的时代中，移民活动对于社团中结核病流行病的影响已成为一个重要的公共卫生课题。1986～1997年，美国中出生于其他国家而被诊断为结核病者的数目上升了65%，即由4 952人上升至7 702人，目前仍占病例的39%。

不同的分子流行病学方法已成功地用于研究个体移民、移民集体以及整个移民活动对于社团中结核病传播的影响。丹麦格陵兰岛中的RFLP分离物与丹麦本土分离物的比较研究发现，3个集体中的一个追踪至来自格陵兰岛的少数几个个体移民。这是第一个证实由移民传播结核病至本土人群的分子生物学研究。在旧金山的另一研究分析了一特定的移民集团，即在墨西哥出生的病人，发现这些人中只有43个病例中的1例引起2个美国出生者的续发性结核感染，但是却有1/5的墨西哥出生地病人是在旧金山感染上结核病的。此种研究尤为重要，因为通过RF LP分析的应用可以证明美国出生的个体可以传播结核病至墨西哥出生的移民。

最近在旧金山进行的一项基于人群的分子流行病学研究对外地出生和美国出生人群的结核病流行方式做了平行比较，结果发现，多数的外地出生者是通过复活过程而发生结核的，而约有1/5的美国出生者则是由于新近感染而得病。在此研究中并不存在有美国和外地出生人群间的传播。与之相同的是，在荷兰也用分子指纹分析法进行了流行病学分析，用以研究不同国籍和相同国籍人群对结核病传播的作用。在623例荷兰籍结核病例中，32%是由于新近感染。而其中约有一半，即整个病例的17%系由非荷兰籍病人的传播而得病。可见在荷兰约有半数的新近传播出现于移民群体，而多数的传播发生在相同国籍的人群之中。因此将注意力集中于外地出生人群的个体流行病学特点并制定对其的结核病控制方案，必将促使这类高危人群中疾病发病率降低。

四、未来的发展方向

（一）全球性传播

前所未有的大量旅游者通过国境以及现有的快速和便捷的交通工具可导致传染病的全球化。现已证实可将结核分枝杆菌分离物导入发病率低的国家，由其他地区导入的结核病常可使传播增加。而且在某些情况下可导入MDR结核病的性型菌株。在荷兰曾发现有来自埃塞俄比亚分离物的少数相匹配程式。就MDR结核而言，一个移民经过洲际飞行后可以接触到许多的乘客。在世界上的许多其他区域，如亚洲、南美、中东和非洲内都有地区特异性的结核分枝杆菌特异性型别。因此，由于存在有地区特异性菌株，就使通过国家和大洲间的追踪成为可能。对全球性传播方式的了解可以指导和提高现有的控制措施，制定新的方案以防止疾病高发国家向低发国家间的传播。

（二）高发国家中的传播动力学

在HIV感染高发的国家，如非洲和东南亚地区国家内的结核病发病率迅速增加。因此，在这种流行病正在流行的区域内，很有必要开展基于人群的研究，以确定近期感染与复活感染及再次感染间的相对重要性。同样，对于诊所、医院及监狱中涉及问题程度的确定将有助于发展导致以后传播速率降低的特异干预措施。具备可靠的有关年度感染危险性的年度流行病学资料、HIV阳性率和实验室的较好质量的现有流行病学控制方案，在进行分子流行病学的彻底方法学研究中，是不可缺少的。因此在发达国家进行这项研究之前，必须建立研究课题的方案和在一定条件下完成成一课题的保证。

（三）结核病控制的评估

DNA指纹分析亦可用作评估结核病控制方案的工具。在旧金山的研究证实增强结核病的控制能减少近期感染发生的总数。就不同集团人群的分析而言，在美国出生人群、感染HIV人群、年龄小于50岁的人群以及非洲籍美国人之间，并无病例比例上的差异。最近，在瑞士有一项研究曾对过去3年时间内所分离的所有菌株进行分析，以确定瑞士苏黎世市结核病控制现代措施的功效。结果发现与此集团有关的病人总数只占17.5%，显然低于同样很少有传播发生的国家相类似的地区。在此项研究中的低水平近期传播提示，该市的结核病控制一般功效可在将来用作为评估结核病控制方案成功或失败的比较标准。

（四）发病机制

据报道结核病的流行有低速传播和快速传播之分。此种传播速率上的差异系由传播来源病人的临床特征（如是否有肺部空洞的存在）以及传播发生的环境（如潜水艇中的通气有限）所决定。但是也有一些少见的大量菌株集中而无异常的临床特征可以解释高传播的发生。流行病学和动物模型中的观察支持有毒力菌株存在的可能性。可疑毒力菌株的传播曾在合并使用良好动物模型和分子流行病学方法的情况下进行分析。在这次流行中，有关菌株的生长特征大大地超过了其他已知的毒力菌株以及其他临床结核分枝杆菌分离物。在此项研究中的结核菌素阳性率是根据其他菌株所预期频率的3～4倍。结核分枝杆菌的广泛传播提示这是由于菌株毒力的增加，而不是由于病人的环境或临床特征所致。然而非预料所及，发展成活动性疾病的比率并不高。显然在此情况下，公共卫生管理机构就必需采取迅速反应，立即使用预防性化学疗法以防止活动性病例数目的增加。曾选择了与这次流行有关菌株的两者之一进行全部基因组序列的检测。应用微量检定法（microassay）对毒力菌株和无毒菌株作进一步的基因比较，将有助于鉴定出决定毒力因子的基因，如决定结核分枝杆菌传播、隐性感染和活动性疾病的基因。

（五）DNA微量检定法

最近已对结核分枝杆菌的全部基因组进行了测序。今后的研究目标将是鉴定出决定致病性的基因以及了解这些基因在发病机制中的作用。一种新的分子生物学方法，DN A微量检定法可将数千个别序列密集于高密度的检定法中，是一种快速检查大量DN A序列的实用方法。这种方法也曾用于结核分枝杆菌的检查。理论上DN A检定法也可用作分子流行病学方法，用以检查全部基因组，而不只是检查小型的插入序列。在DN A微量检定法中，如用全部序列作为模板，结核分枝杆菌分离物以及其他分枝杆菌分离物都可用以进行分析，相同和不同序列区域的鉴定可显示出重要的临床和流行病学表型的存在。DN A微量检定法是一种很有希望的方法，在不久的将来亦可用作更为细致研究分枝杆菌种系发育的工具。

六、结论

虽然分子流行病学是一个相当新的领域，但它在结核病研究中却已成为一种重要的研究方法。RFLP分型法为结核病传播动力学、可疑疾病传播的确定、新近感染、再次感染和复活感染的区别、社团内和社团间传播的证实以及传播能力增强菌株的鉴定等方面都可提出有意义的信息。

（余传霖）

参考文献

1.Raviglione MC，Dye C，Schmidt S，et al.Assessment of world wide tuberculosis control.W H O Global Suuveillance and Monioring Project.Lancet，1997，350（9078）：624～629

2.Cole ST，Brosch R，Parkhill J，et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence.Nature，1998，393（6685）：537～544

3.Thierry D，Brisson－Noel A，Vincent－Levy－Frebauly V，et al.Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence IS6110 and its application in diagnosis.J Clin Microbiol，1990，28（12）：2 668～2 673

4.Van Soolingen D，de Haas PE，Hermans PW，et al.Comparison of various repetitive DN A elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，1993，31（8）：1 987～1 995

5.Agasino CB，Ponce de Leon A，Jasmer R M，et al.Epidemiology of Mycobacterium tuberculosis strains in

San Francisco that do not contain IS6110.Int J Tuberc Lung Dis，1998，2（6）：518～520

6.Samper S，Martin C，Pinedo A，et al.Transmission between HIV－infected patients of multidrug－resistant tuberculosis caused by Mycobacterium bovis.AIDS，1997，11（10）：1 237～1 242

7.Small PM，Hopewell PC，Singh SP，et al.The epidemiology of tuberculosis in San Francisco，apopulationbased study using conventional and molecular methods，New Engl J Med，1994，330（24）：1 703～1 709

8.Chaves F，Yang Z，el Hajj H，et al.Usefulness of the secondary probe pTN12in DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，1996，34（5）：1 118～1 123

9.Strassle A，Putnik J，Weber R，et al.Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis strains isolated from patients in a human immunodeficiency virus cohort in Switzerland.J Clin Microbiol，1997，35（2）：374～178

10.The RW，Ponce de Leon A，Agasino CB，et al.Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes.J Infect Dis，1998，177（4）1 107～1 111

11.Burman WJ，Reves RR，Hawkes AP，et al.DNA fingerprinting with two probes decreases clustering of Mycobacterium tuberculosis.AM J Respr Crit Care Med，1997，155（3）：1 140～1 145

12.Hermans PW，Messadi E，Guebrexabher H，et al.Analysis of the population structure of Mycobacterium tuberculosis in Ethiopia，Tunisnia and the Netherlands，usefulness of DNA typing for global tuberculosis.J Infect Dis，1995，171（6）：1 504～1 513

13.Collins DM，HilbinkF，West DM，et al.Investigation of Mycobacterium paratuberculosis in sheep by fecal culture.DNA characterization and the polymerase chain reaction.Vet Rec，1993，133（24）：599～600

14.Hermans PW，van Soolingen D，van Embden JD.Characterization of a major polymorphic tandem repeat in Mycobacterium tuberculosis and its potential use in the epidemiology of Mycobacterium kansasii and Mycobacterium gordonae.J Bacteriol，1992，174（12）：4 157～4 165

15.Poulet S，Cole ST.Characterization of the highly abundant polymorphic GC－rich－repetitive sequence（PGRS）present in Mycobacterium tuberculosis.Arch Microbiol，1995，163（2）：87～95

16.Kamerbeck J，Schouls I，Kolk A，et al.Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology.J Clin Microbiol，1997，35（4）907～914

17.Friedman CR，Stoeckle MY，Johnson WD Jr，et al.Double－repetitive－element PCR method for subtyping Mycobacterium tuberculosis clinical isolates.J Clin Microbiol，1995，33（5）：1 383～1 388

18.Haas WH，Butler WR，Woodley CL，et al.Mixed－linker polymerase chain reaction，a new method for rapid fingerprinting of isolates of the Mycobacterium tuberculosis complex.J Clin Microbiol，1993，31（5）：1 293～1 298

19.Goyal M，Saunders NA，van Embden JD，et al.Differentiation of Mycobacterium tuberculosis isolates by spoliotyping and IS6110restriction fragment length polymorphism.J Clin Microbiol，1997，35（3）：647～651

20.Fomukong N，Beggs M，el Hajj H，et al.Differences in the prevalence of IS5110insertion sites in Mycobacterium tuberculosis strains，low and high copy number of IS5110.Tuberc Lung Dis，1997，78（2）：109～116

21.van Deutekom H，Gerritsen JJ，van Soolingen D，et al.A molecular epidemiological approach to studying the transmission of tuberculosis in Amsterdam.Clin Infect Dis，1997，25（5）：1 071～1 077

22.Genewein A，Telenti A，Bernasconi C，et al.Molecular approach to identifying route of transmission of tyberculosis in the community.Lancet，1993，342（8 875）：841～844

23.Small PM，Shafer RW，Hopewell PC，et al.Exogenous reinfection with multidrug－resistant Mycobacterium tuberculosis in patients with advanced HIV infection.New Engl J Med，1993，128（16）：1 137～1 144

24.Wurtz R，Demarais P，Trainor W，et al.Speciemen contamination in mycobacteriology laboratory detected by peudo－outbreak of multidurg－resistant tuberculosis.analysis by routine epidemiology and confirmation by molecular techniques.J Clin Microbiol，1996，34（4）：1 017～1 019

25.Behr M A，Hopewell PC，Paz EA，et al.Predictive value of contact investigation for identifying recent transmission of Mycobacterium tuberculosis.Am J Respr Crit Care，1998，158（2）：465～469

26.Behr M A，Warren SA，Salomon H，et al.Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear－negative for acid－fast bacilli.Lancet，1999，353（9 151）：444～449

27.Mc Kenna M Y，McCray E，Onorrato I.The epidemiology of tuberculosis among foreign－born persons in the United States，1986～1993.New Engl J Med，1995，332（16）：1 071～1 076

28.Yang ZH，de Haas PE，van Soolingen D，et al.Restriction fragment length polymorphism Mycobacterium tuberculosis strains isolated from Greenland during 1992，evidence of tuberculosis transmission between Greenland and Denmark.J Clin Microbiol，1994，32（12）：3 018～3 025

29.Chin DP，DeRiemer K，Small PM，et al.Differences in contributing factors to tuberculosis incidence in USborn and foreign－born persons.Am J Respr Crit Care Med，1998，158（6）：1 797～1 803

30.Borgdorff M W，Nagelkerke N，van Soolingen D，et al.Analysis of tuberculosis transmission between nationalities in the Netherlands in the period of 1993～1995 using DN A fingerprinting.Am J Epidermiol，1998，147（2）：187～195

31.Aguado JM，Ramos JT，Lumbreras C.Transmission of tuberculosis during along airplane flight.New Engl J Med，1996，335（9）675～679

32.Plyffer GE，Strassle A，Rose N，et al.Transmission of tuberculosis in the metropolitan area of Zurich，a 3 years survey based on DN A fingerpriting.Eur Respir J，1998，11（4）804～808

33.Frieden TR，Sherman LF，Maw K L，et al.A multi－instututional outbreak of highly drug－resistant tuberculosis，epidermiology and clinical outcomes.JA M A，1996，276（15）：1 229～1 235

34.Valway SE，Sanchez MP，Shinnick TF，et al.An outbreak involving extensive transmission of a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis.New Engl J Med，1998，338（10）：633～639

35.Bloom BR，Small PM.The evolving relation between humans and Mycobacterium tuberculosis.New Engl J Med，1998，338（10）：667～678

36.Gingeras TR，Ghandour G，Wang E，et al.Simultaneous genotyping and species identification using hybridization pattern recognition analysis of generic Mycobacterium DN A arrays.Genomic Res，1998，8（5）：435～448

37.Behr M A，Wilson M A，Gill WP，et al.Comparative genomics of BCG vaccines by whole－genome DN A microassays.Science，1999，284（5 419）：1 520～1 523

38.Bejhr M A，Small PM.Molecular fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis：how can it help the clinicians？.Clin Infect Dis，1997，25：806～810