融合技术进军果树品种改良

4　植物原生质体培养、融合技术进军果树品种改良

世界上的生物种类繁多，千差万别，五彩缤纷，但一切生物的基本结构单位都是细胞。与动物细胞相比，植物细胞的显著特征之一是具有主要由纤维素组成的网状结构——细胞壁。细胞壁具有多种生理功能，它与其他的细胞器息息相关，对细胞原生质体的生命活动有很大影响。但它的存在给细胞生物学的研究带来一定的困难和复杂性。目前，已知植物原生质体及其衍生系统，不仅是探索生命活动理论研究的良好体系之一，还可以通过原生质体培养开展原生质体融合与体细胞杂交研究，从而应用于农作物和经济植物的某些性状的改良及获得多倍体和体细胞杂种，在生产上应用前景广阔。因而人们很早就期望得到裸露的植物细胞——原生质体。早在1880年Hanstein首次启用原生质体一词，Cocking于1960年首次用酶解法降解细胞壁，获得了番茄根尖原生质体，有力地促进了近代植物原生质体研究的迅速发展。1971年Takebe等便在世界上第一个获得了烟草叶肉原生质体培养再生植株的成功，1985年和1986年Fujimura等和Spangenberg等也分别得到了水稻和油菜原生质体培养的再生植株。

近年来，植物原生质体培养再生技术取得了长足的进步。全世界已有分属于茄科、十字花科、菊科、豆科和禾本科等49个科、146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株。研究的对象，以农作物和经济植物为主，并出现了从一年生向多年生、从草本植物向木本植物、从高等植物向低等植物扩展的趋势。在原生质体培养再生技术的基础上，原生质体融合技术迅速发展，目前已经开发了体细胞/配子体原生质体融合和原生质体/亚原生质体融合等不对称融合技术，建立了更有效的融合、杂种筛选和鉴定系统，使原生质体融合成为基因转移的一种有效途径，日益显示出它在作物品种改良，获得新的杂交种方面的巨大潜力。

在果树方面，由于果树大部分属于多年生木本植物，育种周期长，遗传背景复杂，常出现有性杂交不亲和性，对常规育种带来许多困难，而果树基因工程育种，主要局限于单基因或少数基因控制的性状转移有效，对多基因控制的，与果树高产、优质、抗逆性有关的性状，则很难凑效。因此，原生质体培养再生技术和原生质体融合技术，将会在果树目标育种上发挥其独特作用。事实上也是这样，果树原生质体培养的研究在烟草获得成功以后不久便开始了。柑橘是所有果树中，原生质体培养研究最早、进展最快的树种。1975年，以色列的Vari等，首次获得Shamouti甜橙的原生质体培养再生植株。1983年日本的Kobayashi也获得了Trovita甜橙原生质体培养再生植株。1988年邓秀新等也从锦橙和山金柑珠心诱导的愈伤组织分离原生质体，并培养出再生植株。迄今，已获得了10科16属果树的原生质体再生植株，包括柑橘类、苹果、葡萄、梨、猕猴桃、荔枝、李、杏、枣、枇杷等大宗果树。许多研究者，还把这一技术应用于进一步的细胞融合、突变体筛选和遗传转化的研究中。1985年，Ongawara等采用PEG(聚乙二醇)诱导融合，首次获得了柑橘的体细胞杂种植株，这标志着原生质体融合技术在果树品种改良上应用的开始。随后，又获得了猕猴桃、菠萝、柿子等多种果树的种内、种间、属间、亚族间，甚至亚科间的近100个组合的体细胞杂种或胞质杂种。目前，采用原生质体培养、融合技术，虽然还没有培养出一个理想的新品种，但已得到了可望作为多抗砧木类型或有价值的育种材料的融合杂种新种质。

在果树中，柑橘类原生质体研究，为什么进展较快、成绩突出呢?这主要是因为植物原生质体培养、融合技术，为解决柑橘育种工作中遇到的珠心胚干扰、性器官败育等提供了有效手段。胚性愈伤组织是进行柑橘原生质体培养和融合的最佳起始材料。如何才能获得胚性愈伤组织呢?

所谓胚性愈伤组织是指由组织培养中外植体(被培养的细胞、组织或器官等)产生的具有胚胎发生能力的愈伤组织。获得胚性愈伤组织有多条途径。一般是由开花后2～8周的珠心组织，培养在MT基本培养基上，附加吲哚乙酸0.1～0.5毫克/升、激动素0.5～1.0毫克/升，即可诱导出胚性愈伤组织。其次，从败育的胚珠中也可诱导出胚性愈伤组织。邓秀新等1988年把成熟的山金柑种子播在MT基本培养基中，50天后有16.7%的幼苗从子叶下0.1～2.0厘米处也产生了胚性愈伤组织。迄今，邓秀新柑橘团队，已建立起包含世界主要种类和品种70余个基因型胚性愈伤组织库。“脐橙”败育胚珠易诱导胚状体，而不易获得能继代培养的胚性愈伤组织，叶新荣等在1991年，在MT基本培养基中加入AgNO₃ 5毫克/升，以抑制乙烯产生，获得了该品种的胚性愈伤组织。通过以上各类途径获得的柑橘类愈伤组织在无外源激素的MT培养基中均能继代保存，并能保持较好的胚胎发生能力，可作各类研究材料使用。

有了胚性愈伤组织后又如何进行原生质体培养再生植株呢?

目前，果树原生质体的分离都采用一步法，即将混合酶液中所有成分配在一起，酶解一次完成，胚性愈伤组织与酶液之比为1∶10。因为柑橘愈伤组织含有较多的淀粉粒，酶解时易破裂，为解决这一问题，可在酶液中加入一些渗透压稳定剂和膜稳定剂，并采用低浓度酶液(果胶酶和纤维素酶各0.3%～0.5%)。酶解在恒温(25～28℃)、黑暗或弱光下进行。低速摇动(35～40转/分钟)，能够加速原生质体的释放。酶解时间，通常在10～20小时之间。酶解完毕，采用甘露醇-蔗糖界面离心法收集、纯化原生质体。

获得了原生质体之后，可采用液体浅层培养。该培养方式通气性好，便于添加新鲜培养基和培养物转移，成株时间也缩短，是果树上广泛采用的方法之一。近年来，人们采用低熔点琼脂糖包埋法对原生质体融合体进行培养，其效果优于液体浅层培养。具有促进原生质体分裂的作用。1992年Ochatt等采用固液双层培养，促进了梨的原生质体再生。Grosser等人取消了MT基本培养基中对原生质体有毒害的无机态氮，采用谷氨酰胺为氮源，建立了BH₃培养基，大大提高了柑橘原生质体的分裂频率，已成为柑橘原生质体培养中较为通用的培养基。柑橘原生质体可以在不加任何外源激素的情况下就能分裂，形成多细胞团，进而发育成胚状体。而其他果树原生质体培养时，则必须加入生长素类和细胞分裂素类。用电脉冲处理原生质体，促进了细胞分裂和植株分化。

果树原生质体再生植株的方式，可经由胚状体发育成植株，也可从愈伤组织诱导根、芽分化，长成完整植株。在后一途径中，不定芽的诱导是关键步骤，主要是通过调节培养基中CTK/IAA比值来实现的。提高CTK/IAA比值有利于芽的分化。分化培养基的蔗糖浓度，以2%～3%为适宜。供试植株最好生长在控制条件下，可提高原生质体的细胞分裂率和再生能力。通过大量试验结果分析，原生质体培养再生植株能否成功，主要取决于三个关键环节:一是培养植物材料的基因型选择;二是原生质体来源的选择;三是培养基、培养方法和培养条件的选择。以上三个环节，如果能够环环扣紧，就可以获得成功。

在原生质体培养技术基础上，如何进行细胞原生质体融合，产生体细胞杂种呢?具体方法，可以采用聚乙二醇(PEG)诱导融合法。就是将一个亲本的胚性愈伤组织或悬浮细胞系的原生质体与另一个亲本的叶肉细胞原生质体融合(见图7)。近年来，有人采用电场诱导融合也得到了柑橘体细胞杂种。融合后的原生质体，经再生技术体系，获得再生植株。在培养过程中，再生植株必须通过植物形态、染色体数目、同工酶谱和脱氧核糖核酸(DNA)图谱等指标进行鉴定，以确认是否为体细胞杂种。

体细胞杂交后，把不同亲本的所有遗传物质都融合在一起，很难排除不利性状的进入。近年来，采用胞质杂种，巧妙地解决了这一难题。Vardi等1987年应用供/受体融合系统，得到了具有枳橙胞质和酸橙细胞核的胞质杂种。

利用原生质体融合及其相关技术也可培养出三倍体品种。目前，主要有两个途径:一是用一亲本的体细胞原生质体与另一亲本的性细胞(如花粉母细胞减数分裂后的四分体小孢子)原生质体融合，培养再生植株，一步即可获得三倍体类型;二是将体细胞杂种与二倍体品种杂交，也可培育出三倍体品种。华中农业大学柑橘研究所运用这一途径，获得了三倍体柑橘植株。

图7　植物体细胞杂交的主要环节示意图

由于原生质体培养再生植株，都是单细胞起源的，每个原生质体都有同等的再生机会。因而，原生质体培养为突变体的分离、纯化及离体诱变提供了有效途径。Gentile等1992年利用原生质体再生体系，获得了抗黑星病的柠檬突变体。还可以利用聚乙二醇诱导或电激法进行遗传转化研究，已再生出了转基因植株。

在果树生产上，还可利用原生质体培养、融合技术，使一些有益的基因资源转移到生产上的砧木中，从而有可能得到组合多种抗性性状的砧木类型，甚至成为广亲和的通用砧木。原生质体培养、融合技术，还可应用于栽培(接穗)品种的改良。原生质体融合产生的杂种常导致育性下降或不育，这对于多数采用无性繁殖的果树来说，育性下降或不育倒是个优良性状，可能产生无籽(或少籽)果实。同时由于果树是可以进行无性繁殖的植物，通过原生质体培养、融合所获得的杂种，只要农业性状优良，符合育种目标，那就可以直接采用无性繁殖方法获得遗传性状稳定的无性系品种。这体现出原生质体培养、融合技术在果树品种改良上的特殊价值，其应用前景是无限广阔的。