任务6.5食品中大肠菌群的检验

任务6.5　食品中大肠菌群的检验

6.5.1　大肠菌群简介

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语。它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界中广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生检测工作中。

6.5.2　大肠菌群检验方法

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前，国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。

1）国家标准

国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。

（1）乳糖发酵试验

样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

（2）分离培养

将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18～24h，观察菌落形态。

（3）证实试验

挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。

2）行业标准

行业标准指原国家商检局制定的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：

（1）推测试验。样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

（2）证实试验。将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每mL（g）样品中大肠菌群的MPN值。

6.5.3　大肠菌群检验说明

1）MPN检索表

MPN为最大可能数（Most Probable Number）的简称。这种方法对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。

MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。

2）初发酵和证实试验

无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必须的。

3）产气量与倒管

在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。

4）挑选菌落

国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠杆菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。

另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。

5）抑菌剂

大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其他杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。

国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。

抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。

6.5.4　大肠菌群检验步骤（乳糖发酵法）

1）设备和材料

冰箱0～4℃，恒温培养箱37℃，高压灭菌锅，恒温水浴锅45℃，酒精灯，试管及吸管，锥形瓶500mL，平皿，载玻片，盖玻片等。

2）培养基和试剂

（1）乳糖胆盐发酵管

成分：蛋白胨20g，猪胆盐5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，蒸馏水1000 mL；pH值为7.4。

制法：将蛋白胨、猪胆盐及糖溶于水中，校正pH值，加入溴甲酚紫水指示剂，分装每试管约10mL，并放入一个小导管，115℃高压灭菌15min。双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。

（2）伊红美蓝琼脂平板（EMB）

成分：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂17g，2%伊红Y溶液20mL，0.65%美蓝液10mL，蒸馏水1000mL，pH值为7.1。

制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH值，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

（3）乳糖发酵管

成分：蛋白胨20g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，蒸馏水1000mL；pH＝7.4。

制法：加蛋白胨及乳糖糖液于水中，校正pH值，加入指示剂溴甲酚紫水溶液，分装于试管，每个试管倒放入一个小导管，在121℃高压灭菌15min，备用。

（4）EC肉汤

成分：蛋白胨20g，3号胆盐（或混合胆盐）1.5g.乳糖5g，磷酸氢二钾4g，磷酸二氢钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL。

制法：将上述成分混合溶解后，分装入有发酵导管的试管中，121℃高压灭菌15min，最终pH值为6.9±0.2，备用。

（5）磷酸盐缓冲液

储存液：先将34g磷酸二氢钾溶解于500mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH＝7.2后，再用蒸馏水稀释至1000mL。

稀释液：取储存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL。分装每瓶100mL或每管10 mL，121℃高压灭菌15min，备用。

（6）0.85%灭菌生理盐水

（7）革兰氏染色液

①结晶紫染色液：将1g结晶紫溶解于20mL95%乙醇中，然后与80mLl%草酸铵水溶液混合。

②革兰氏碘液：将1g碘与2g碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

③沙黄复染液：将0.25g沙黄溶解于10mL95%乙醇中，然后用90mL蒸馏水稀释。

3）操作步骤（图6.38）

（1）采样

①固体和半固体样品：以无菌操作称取25g样品，放入盛有225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000～10000r/min的均质1～2min，或放入盛有225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，做成1:10的均匀稀释液。

②液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

（2）稀释

①以无菌操作，将检样25g（或25mL）放到含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体样品在加入稀释液后，最好置匀制器中以8000～10000r/min的速度处理1min，做成l:10稀释液。

②用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管，混合均匀，做成1:100稀释液。

③另取1mL灭菌吸管，按上条操作顺序，做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管。

④根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的分析，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管。

图6.38　乳糖发酵检验大肠菌群流程

（3）乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖发酵管内，接种量在1mL及1mL以下时，用单料乳糖胆盐发酵管。每个稀释度接种3管，放在36±1℃恒温箱内，培养24±2h，观察是否产气。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则进行进一步的试验。

（4）分离培养

将产气的发酵管用划线法分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，放在36±1℃恒温箱内，培养18～24h，然后取出，观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有呈紫黑色，不带或略带金属光泽或粉紫色，中心较深的菌落，也应挑选出来，并做革兰氏染色和证实试验（图6.39）。

图6.39　平板培养大肠菌群典型菌落

（5）证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，放在36±1℃恒温箱内，培养24±2h，观察产气情况。凡有乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

（6）结果报告

详细记录试验现象。

根据证实为大肠菌群阳性的试管数量，查表，报告每100mL大肠菌群的MPN值（表6.4）。

表6.4　大肠菌群最可能数（MPN）检索表

4）注意事项

①大肠菌群是一群肠道杆菌的总称，其菌落的形态、色泽等方面比大肠杆菌更复杂和多样。大肠菌群在伊红美蓝培养基上的特征有以下几种：

a.深紫黑色，具有金属光泽的菌落。

b.紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。

c.淡紫红色，中心色泽较深的菌落。

a、b两种特征菌落大肠菌群检出率高于c。挑取菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落，应多挑几个，以免出现假阴性。

②胆盐作为抑菌剂，抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。

③在查阅MPN检索表时，当三个稀释度检测结果均为阴性时，MPN＜30或＜3判定。

④在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的mL（g），是指原样品的体积（质量），并非样品稀释后的体积（质量）。

6.5.5　大肠菌群检验步骤（滤膜法）

滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数（MPN）。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。

1）准备工作

（1）滤膜灭菌

将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。

（2）滤器灭菌

准备容量为500mL的滤器，用121℃高压灭菌20min。

2）培养

①将品红亚硫酸钠平板培养基放入37℃培养箱内预温30～60min。

②过滤水样。

a.用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在－50kPa压力下进行抽滤。

b.水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16～18h。

3）结果判定

①挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。

a.紫红色，具有金属光泽的菌落。

b.紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。

c.淡紫红色，中心色泽较深的菌落。

②凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌，都需要再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37℃培养6～8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。