食品中大肠菌群的平板计数

实训24　食品中大肠菌群的平板计数

一、实训目的

（1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。

（2）学习并掌握大肠菌群的检验方法。

二、实训原理

食品中大肠菌群数是以每100g（mL）检样内大肠菌群最可能数（most probable number，MPN）表示。

从种类上讲，大肠菌群包括许多生化及血清学特性很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属、枸橼酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等。因此，该菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌。

大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其他杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。大肠菌群的特点及检测意义见模块二项目2．1下任务6。

三、实训器材

1．器具

灭菌的锥形瓶，试管，量筒，吸量管，培养皿，玻璃涂布棒，接种环，接种针，纱布等。

2．试剂

1mol／L　NaOH溶液，1mol／L盐酸，磷酸盐缓冲液，无菌生理盐水。

3．培养基

结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）培养基（表3－11）。

表3－11　结晶紫中性红胆盐琼脂培养基成分表

四、实训步骤

1．检样稀释

（1）固体和半固体样品：将225mL稀释液转入无菌均质杯或均质袋中。称取25g样品，放入盛有225mL稀释液的无菌均质杯中，8000～10000r／min均质1～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成10^－1稀释度的样品匀液。

（2）液体样品：以无菌吸量管吸取25mL样品，置于盛有玻璃珠的225mL稀释液中，充分混匀，制成10^－1稀释度的样品匀液。

（3）样品匀液的pH应在6．5～7．5之间，必要时分别用1mol／L　NaOH溶液或1 mol／L盐酸调节。

（4）用1mL无菌吸量管吸取10^－1样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸量管尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸量管反复吹打，使其混合均匀。制成10^－2稀释度的样品匀液。

（5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸量管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

2．接种平板培养

选取2～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌培养皿，每皿1mL。同时取1mL无菌生理盐水加入无菌培养皿作空白对照。

及时将15～20mL冷至46℃的VRBA培养基倾注于每个培养皿中。小心旋转培养皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3～4mL　VRBA培养基覆盖平板表层。凝固后翻转平板，置于（36±1）℃培养18～24h。

3．平板菌落数的选择

选择菌落数在15～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0．5mm或更大。

4．证实试验

（1）煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤的配制（表3－12）。

表3－12　煌绿乳糖胆盐肉汤成分表

牛胆粉溶液的配制：将20．0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7．0～7．5。

0．1%煌绿水的配制：将0．1g煌绿溶于100mL蒸馏水中。

培养基的配制：将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL，用蒸馏水稀释到975mL，调节pH至7．2±0．1，再加入0．1%煌绿水溶液13．3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121℃高压灭菌15min。

（2）接种培养：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，（36±1）℃培养24～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

5．大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以选好的用来计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为1g（mL）样品中大肠菌群数。

例：10^－4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为100×6÷10×10⁴＝6×10⁵CFU／mL。

五、思考题

（1）测定食品中大肠菌群有何卫生学意义？

（2）食品中大肠菌群是怎样测定的？

（3）怎样报告食品中大肠菌群的测定结果？