离子注入诱变筛选低产高级醇果酒酵母

离子注入诱变筛选低产高级醇果酒酵母

李春明　赵树欣　李凤美

摘要：本文采用离子注入对一株黎族酒曲中分离的酵母TQ601诱变选育，依次通过乳酸培养基、产酸培养基和TTC上层平板初筛，再经果汁发酵复筛，并用气相色谱法测定果酒中高级醇含量，最终得到一株TQ105高级醇产量降低了34.5%的菌株。

关键词：酵母，离子注入，高级醇，气相色谱

高级醇（higher alcohols）是指碳原子数超过2的脂肪醇的混合物，是果酒中重要风味物质。苹果酒中的高级醇主要有正丙醇、正丁醇、异丁醇、戊醇、异戊醇、活性戊醇、辛醇、色醇、酪醇等。适量的高级醇使酒体具有丰满的香味和口味，并增加酒的协调性，赋予酒醇厚感，但含量过高也会影响酒的质量与风味，使酒具有不愉快的苦味，更重要的是影响饮用者的健康，容易使人头痛致醉，故其含量必须控制在一定的范围内。鉴于高级醇在果酒中的重要性，筛选低产高级醇的果酒酵母，对于提高果酒的质量和风味有着很重要的意义。

高级醇是酵母酒精发酵正常的副产物，其主要有两条途径形成。早在1907德国化学家埃尔利希（Felix Ehrlish）就提出了啤酒中高级醇形成的机理，他认为醇类是原料中的蛋白质经过分解发酵生成的。1953年哈里斯（Harris）研究并提出了高级醇由糖代谢通过丙酮酸合成的途径。并且证明了两种途径对于高级醇的生成都同等重要。

图1　Ehrilish合成途径

图2　Harris合成途径

（天津工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院30022）

离子注入诱变育种技术是近些年发展起来的物理诱变技术。离子在注入过程中不断与生物分子键合，置换或填充空位形成新的分子基因，既存在着电荷交换，能量交换，动量交换等过程，又存在着入射粒子沉积过程，动量，能量，电荷，质量四种作用均可引发不同的生物学效应。最主要的是离子注入可引起DNA键断裂，致使大量受体原子移位，重组，形成新的分子结构和基因，产生丰富基因突变，从而获得高突变率。该技术能以较小的生理损伤得到较高的突变率、较广的突变谱，而且具有设备简单、使用方便，成本低廉、对人体和环境无害等优点，因此将有很好的发展前景。

1　材料与方法

1.1　出发菌株

TQ601分离自海南省五指山黎族酒曲。

1.2　培养基

1.2.1　发酵培养基

70Bx苹果浓缩汁稀释至20Bx。

1.2.2　YEPD

蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，pH6.0。

1.2.3　乳酸培养基

乳酸4%，硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.01%，硫酸镁0.05%，氯化钙0.01%，酵母膏0.02%，pH6.0。

1.2.4　酵母产酸培养基

在YEPD固体培养基中加入干热灭菌后的碳酸钙0.5%。

1.2.5　TTC上层培养基

TTC0.05%，乳酸0.5%，琼脂1.5%，pH6.0。

1.3　离子注入诱变方法

1.3.1　N⁺离子注入前样品的制备

取培养24 h后的活化菌种一环于25mlYEPD液体培养基培养至对数期，取0.1ml菌液均匀涂于平皿底大约硬币大小面积，以在显微镜下观察无相互重叠的细胞为宜。用无菌风吹干后立即进行N+注入。

1.3.2　N⁺注入处理

注入能量为30 keV，注入剂量为1×10⁵，2×10⁵，3×10⁵，5×10⁵，8×10⁵，1×10⁶每秒离子数，注入靶室的真空度为10^-3Pa，束流量为1 mA。

1.3.3　N注入后的培养

⁺

将待注入样品做好组标记后，放入靶室。经过不同剂量的照射后，盖上培养皿盖，并在样品上滴加1ml无菌水。用灭过菌的橡皮擦下菌体，取0.1ml菌液作十倍稀释。

1.4　筛选方法

1.4.1　初筛

将诱变处理过的酵母细胞均匀涂布在乳酸培养基上，置黑暗处25℃培养3～5d。挑选生长菌落较大、菌层较厚的菌株转接于酵母产酸培养基上于25℃培养3d，菌落影印到乳酸培养基上，25℃培养3d。菌落长成后加入TTC暗培养2～3h，挑选出在酵母产酸培养基上生长较好、中央隆起较突出、溶钙圈较适中、乳酸培养基上红色较深的菌株。

1.4.2　复筛

稀释至20Bx苹果浓缩汁200ml于22℃发酵9天，测定高级醇含量，选择低产高级醇的菌株。

1.5　气相色谱测定高级醇

1.5.1　相对校正因子的测定

以正丁醇作内标，分别用移液管移取气相色谱标准物均为1g/L的甲醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇各1ml于100ml容量瓶中，以40%乙醇定容，混匀后进样，进样量不超过1μl，即可测定各组分的相对较正因子。

1.5.2　内标法测定高级醇

以正丁醇为内标物，在10ml容量瓶中准确加入0.1ml 1g／L正丁醇，以酒样定容至刻度，混合均匀后即可进样。

2　结果与讨论

2.1　酵母生长曲线

取1环冰箱保存的TQ601于5mlYEPD液体培养基活化24小时，吸取1ml菌液转接于100ml YEPD液体培养基，震荡培养，每2小时测1次OD值。由图3可知，在4小时开始进入对数期，诱变选在培养8小时后进行。

图3　酵母生长曲线

2.2　离子注入诱变后初筛结果

诱变后菌株的生长情况如图4乳酸平板生长所示，可见诱变后菌株在乳酸平板上生长大小不一，生长较大菌株是能较好的利用乳酸脱氢酶的菌株，也就是说代谢乳酸的能力增强要消耗较多的NADH，也就减少了生成高级醇所要消耗的NADH，即这些菌株有可能是低产高级醇的酵母。挑选在乳酸培养基上较大的菌落大约80株接种到产酸培养基上。产酸培养基上产透明圈适中的菌落为所需要的，将菌落影印到乳酸培养基上，TTC显色后红色较深的菌落为产酒精能力较强的菌落，因此该菌落可能为低产高级醇菌落，挑出接种到YEPD斜面，备用。共挑出18株菌株进一步做发酵复筛试验。

图4　乳酸平板生长情况

注：图4圈注的为较大菌落

图5　产酸培养基生长情况

图6　TTC显色情况

2.3　发酵复筛试验结果

将初筛得到的这18株菌在稀释至20Bx的苹果浓缩汁中22℃发酵9天，发酵结果如表1所示。

表1　发酵后各菌株高级醇产量

注：其中TQ102菌株发酵过程中发酵拴中硫酸有倒吸现象，发酵受到影响。

由发酵后的结果可以看出，18株初筛后的菌株中16株经复筛发酵高级醇的产量低于TQ601发酵高级醇产量。其中TQ105和TQ108高级醇产量低于400mg/l，有7株菌高级醇产量低于500mg/l，另外5株菌高级醇产量低于600mg/l。其中TQ105的高级醇产量仅为396.479mg/l，比原菌株高级醇产量降低了34.5%。

3　结论

本文采用离子注入这一新兴、高效的诱变方法对一株分离自黎族酒曲的酵母TQ601进行诱变处理，经过乳酸培养基，产酸培养基，TTC显色等一系列过程的初筛，初步得到18株菌株。进一步果汁发酵复筛后，除一株发酵失败外另外15株菌的高级醇产量均低于原菌株的高级醇产量。最好的一株菌TQ105醇产量降低了34.5%。离子注入诱变方法虽然是一种高效的诱变方法，但是在人们实践的过程中发现该方法的回复突变率高，因此我们正在用其他诱变方法加以巩固离子注入的诱变效果，以保证获得遗传性状稳定的菌种。

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