对的修饰聚乙二醇又名聚乙烯二醇

6．4．1　PEG对SOD的修饰

聚乙二醇（PEG）又名聚乙烯二醇或聚氧乙烯二醇［CH₃（OCH₂CH₂）_nOH］，有一系列不同相对分子质量的产品，无毒，无免疫原性。Kichter曾对其一系列产品进行了免疫原性研究，证明即使相对分子质量高达10万的PEG也不能在家兔体内诱导出抗体，高达60万的大分子也只能产生极微的抗体。

PEG含有羟基，可以与许多种类的活化剂起反应而被激活，然后再与SOD分子中的ε—NH₂缩合。目前使用的活化剂有氰尿酰氯（cyanuric chloride）、环己基碳化二亚胺（dicycLOHexylcarbodiimide，DCCI）、羟化琥珀酰亚胺（N－hydroxysucciniimide）、1，1′－羰基二咪唑（1，1′－carbonyldiimidazole）、2，4，6－三氯苯基氯甲酸酯（2，4，6－trichlorophenyl chloroformate）等。

6．4．1．1　氰尿酰氯活化法

自从1979年Davis等用氰尿酰氯活化PEG对牛血Cu，Zn－SOD进行共价修饰以来，国内外用此法对Cu，Zn－SOD、Mn－SOD进行了大量修饰研究。其反应机理见图6－1。

图6－1　PEG氰尿酰氯活化法对SOD的化学修饰反应机制

PEG氰尿酰氯活化法对SOD化学修饰的特点：①优点是步骤简单、反应时间短（约1h）、所需试剂易得、方便经济；②缺点是活性回收率低；不适于活性中心具有巯基的酶的修饰，因为它能生成稳定的硫醚衍生物；连接剂的第三个氯可能与蛋白质发生交联，使产品不均一；衍生物在紫外范围内有较大吸收，妨碍光谱学的精确研究；氰尿酰氯本身具有毒性，修饰物的降解产物在体内可能有不良作用。

6．4．1．2　1，1′－羰基二咪唑活化法

1983年Charles等采用1，1′－羰基二咪唑活化PEG得到一稳定的氨基甲酸酯衍生物，然后再与SOD共价连接。其反应机制如图6－2所示。

图6－2　PEG1，1′－羰基二咪唑活化法对SOD的化学修饰反应原理

PEG 1，1′－羰基二咪唑活化法对SOD的化学修饰的特点：①优点是操作简单、活性回收率高（一般大于96%）。②缺点是反应时间长（约96h）、中间产物活性低、蛋白连接率低、修饰物中的酯键易于水解、活化剂不易得到等。

6．4．1．3　环己基碳化二亚胺和羟化琥珀酰亚胺活化法

1983年Boccu、Veronese等将固定化酶法用于SOD的修饰，即先使PEG的ω－CH₂OH转变成—COOH，或先将PEG末端—OH转化为—NH₂，与琥珀酸酐反应转化成PEG—NH—CO—CH₂CH₂COOH，再用环己基碳化二亚胺（DCCI）或羟化琥珀酰亚胺活化成活化酯，然后与SOD的赖氨酸残基连接。此方法通过控制活化PEG的不同浓度，可得到不同修饰程度及不同残留活性的SOD。其反应机理如图6－3所示。

图6－3　PEG环己基碳化二亚胺和羟化琥珀酰亚胺活化法对SOD的化学修饰反应原理

PEG环己基碳化二亚胺和羟化琥珀酰亚胺活化法对SOD的化学修饰反应的特点：条件温和，易于控制，产品均一；但需多步活化，且聚合物中间体精制困难、费时，所需活化剂不易得。

6．4．1．4　2，4，5－三氯苯基氯甲酸酯或对－硝基苯基氯甲酸酯活化法

Veronese等采用2，4，5－三氯苯基氯甲酸酯或对－硝基苯基氯甲酸酯活化PEG得到PEG苯基碳酸盐衍生物，然后与SOD共价连接。其反应机理如图6－4所示。

图6－4　PEG 2，4，5－三氯苯基氯甲酸酯或对－硝基苯基氯甲酸酯活化法对SOD的化学修饰反应原理

PEG 2，4，5－三氯苯基氯甲酸酯活化法对SOD的化学修饰反应的特点是：氯甲酸酯法步骤少，时间短，中间体稳定，活化收率高，且当1mol SOD连接10mol PEG后，继续修饰活性不再下降；但活化剂不易获得。