真菌活性多糖

子任务一　真菌活性多糖

一、真菌活性多糖的分类及生理功能

真菌多糖(polysaccharides)又称多聚糖，是主要存在于真菌生物菌丝体细胞壁内并分泌于细胞外的高分子糖类化合物，一般是由10个分子以上的单糖通过糖苷键连接而形成的高分子多聚物，不仅参与组织细胞骨架的构成，而且是多种内源性生物活性分子的重要组成成分。有一定的调节机体免疫功能的作用，其作用是多途径、多环节、多靶点的。如促进免疫细胞增殖与分化、分泌各种淋巴因子、调节神经－内分泌－免疫调节网络(NIM)的平衡等。

早在20世纪50年代Bradner等就提取了酵母多糖，20世纪60年代日本对100多种真菌进行了筛选，70年代我国开展了大量研究。目前，对真菌多糖的研究与利用已成为一个“热点”，真菌多糖对生命科学、医药科学的研究与开发具有重要意义。真菌多糖包括酵母菌多糖、霉菌多糖、真核藻类多糖和大型真菌多糖，我国对可供药用和(或)食用的大型真菌多糖研究较多。如今，我国发现有重要价值的真菌多糖主要有灵芝多糖、香菇多糖、猴头菇多糖、黑木耳多糖、银耳多糖、茯苓多糖、虫草多糖、灰树花多糖等30余种。

(一)灵芝多糖

灵芝是一种名贵药用真菌，具有多种生理功能，是一种不可多得的高级营养食品。灵芝多糖是灵芝主要活性成分之一，它主要是细胞结构物质，在灵芝的发酵菌液中也能得到灵芝菌丝分泌的胞外多糖，国内外已从灵芝中分离到200多个多糖体。从灵芝子实体中分离的灵芝粗多糖D，具有免疫促进作用，可以提高机体对恶劣环境的抵抗力，提高机体的缺氧耐受性，有助于组织获得较多的氧，还有镇静、强心等作用。灵芝多糖有刺激胰岛素分泌的作用，有降血糖功效，还有降血脂、抗炎及改善学习记忆功能等作用。灵芝多糖对O^－的产生和红细胞LPO均有抑制作用，对－OH有清除作用，还使机体代谢产生的氧自由基减少积累量，从而抑制了脂质过氧化功能，起到了抗衰老作用。

(二)香菇多糖

香菇又叫香簟、香菌，是世界上最著名的食用菌之一。除食用外，香菇也可入药，是食药两用菌。香菇多糖是从香菇中提取的一种重要组分。国内外众多研究表明，香菇多糖具有一定的抗肿瘤作用，与其他抗肿瘤化学药物相比，香菇多糖几乎无任何毒副作用。此外，香菇多糖还可改善肌体代谢，增强机体对多种细菌、寄生虫、病毒性感染(包括艾滋病)的免疫能力，香菇多糖及其培养液有护肝并增强肝排毒能力，降低血清转氨酶水平的作用。香菇多糖能提高SOD活性和降低脂褐素含量。香菇多糖有抑制血小板聚集作用，还有一定的抗疲劳作用。由于香菇多糖所具有的营养及保健价值，近年来国内外对其进行了较广泛的开发利用。

(三)猴头菇多糖

猴头菇是一种珍贵的食用兼药用菌，富含多种营养成分。医学研究表明，猴头菇性平，味甘，有利五脏，助消化，滋补身体等功效，特别是对胃溃疡、十二指肠溃疡和神经衰弱等患者有很好的保健效果。猴头菇多糖是猴头菇中重要的生物活性物质，可作为免疫促进剂，能控制细胞的分裂和细胞分化，调节细胞的生长和衰老。经检测，猴头菇多糖具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，对提高肌体免疫力具有重要的作用。可广泛应用于医药、保健品及功能食品。

(四)黑木耳多糖

黑木耳香嫩可口，是一种营养价值极高的黑色滋补食品，有凉血、止血功效，还有补气、益智、生血功能，对贫血、久病体虚、腰腿酸软、肢体麻木等症有效，也有润肺和洗涤肠胃的作用。黑木耳的生物活性主要来自其多糖成分，黑木耳多糖作为“生物应答效应物”，具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎症等细胞保护作用;还具有降低血脂、血糖、血液黏度、胆固醇以及抗糖尿病、抗衰老、抗辐射等多种生理功能;同时还能促进核酸、蛋白质的生物合成和防治多种老年性疾病。

(五)银耳多糖

银耳多糖是从银耳子实体或液体深层发酵的银耳孢子中提取出来的一种活性多糖。大量的现代药理证明，多数药理活性都与酸性银耳多糖有关。从椴木银耳中提取分离得到的酸性银耳多糖具有广泛的药理活性，具有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、抗血栓形成、抗突变等作用，能增强机体耐缺氧能力，清除自由基，抑制肿瘤，能使人体产生抗体及干扰素，可治疗现代医学中的多种疑难病症。

(六)茯苓多糖

茯苓多糖来源于多孔菌科真菌茯苓的菌核，约占整个茯苓菌核干重的70%～90%，其化学组成为(1，3)－β－D－葡聚糖。茯苓多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、增强机体免疫力、保肝、催眠、抗炎、消石等作用，可用于抗肿瘤药物的研发，从而为肿瘤、癌症的治疗提供新的方法，还可作为免疫增强剂，用于保健品的开发与研制。另外，羧甲基茯苓多糖具有水溶性及增稠性，可配制成各种保健食品。

(七)虫草多糖

冬虫夏草，简称虫草，是一种虫生真菌，属麦角菌目麦角菌科虫草属，具有多种药理功能，为中华特产，主要产于中国四川、青海、西藏境内的青藏高原上。冬虫夏草中含有的活性多糖，不仅具有抗肿瘤、降糖、抗肝纤维化作用，还能提高免疫功能及治疗肝的病毒性感染。冬虫夏草多糖能有效地治疗肝病，尤其是肝纤维化，它与公认具有较好效果的抗纤维化药物秋水碱疗效相似且安全。此外，从国外的临床资料报道显示，将冬虫夏草多糖结合其他真菌中提取的多糖，能有效地治疗肝的病毒性感染，从而促进乙型肝炎病毒e抗原的转阴。目前，冬虫夏草制剂在临床上已应用于慢性阻塞性肺病、原发性血小板减少症以及心率失常等多种疾病，并取得了较好的疗效。

(八)灰树花多糖

灰树花是一种珍稀的食药两用真菌，灰树花多糖是以β－1，6－糖苷键为主链，以β－1，3－键和β－1，4－键为支链的葡聚糖。灰树花多糖可以激活细胞免疫功能，提高机体非特异性和特异性免疫，防止正常细胞癌变，抑制肿瘤生长和转移，协同肿瘤的化疗或放疗，发挥免疫化疗或免疫放疗的作用，达到治疗肿瘤的目的。灰树花多糖具有抑制H IV以及改善艾滋病相应症状的能力，还可以有效改善晚期艾滋病患者的并发恶性皮肤癌卡波奇肉瘤。灰树花多糖的X组分可激活被抑制的T细胞活性，减轻肝炎症状。

二、真菌活性多糖的提取工艺

真菌多糖存在于真菌的菌丝体和子实体中，若直接食用不易达到保健治疗作用，只有将其有效成分提取、浓缩和纯化，才能提高功效。

制备真菌活性多糖的原料来源主要有两个:一是直接从真菌子实体中提取;另外一个是通过液体深层发酵得到胞内多糖和胞外多糖，真菌菌丝在液体发酵时，有的将多糖分泌到胞外，形成胞外多糖。有的只留在胞内，形成胞内多糖。真菌活性多糖提取纯化的一般工艺流程，如图7－1所示。

图7－1　真菌活性多糖提取纯化的一般工艺流程

(一)真菌多糖的发酵

真菌多糖的发酵生产一般有固态发酵和液态发酵两种。工业上常采用液态发酵(表面发酵和深层发酵)，即采用液体培养基的发酵技术。在生产上，真菌多糖的液态发酵一般要经过斜面菌种培养、摇床培养、种子罐扩大培养、发酵罐培养等工艺流程;并且根据其工艺可将其培养基分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基，以便在菌丝体生长的不同阶段为其提供良好的营养。

(二)真菌多糖的提取

胞外多糖直接对发酵液进行后处理即可;对于胞内多糖，还要根据多糖的不同性质采用适当的方法对菌丝体进行浸提。大多数真菌多糖可溶于冷水，在热水中呈黏液，遇乙醇能沉淀，故传统的浸提方法多为热水提取法(适用于水溶性多糖)，然后用乙醇等低级醇进行沉淀;另外还有稀酸提取法(适用于酸溶性多糖)与稀碱提取法(适用于碱溶性多糖)。但是，热水浸提法较费时且效率低，而酸碱提取法又较易破坏多糖的空间结构及活性，故目前多采用酶法及超声波提取法等。

(三)真菌多糖的纯化

由上述方法得到的真菌多糖均为多糖粗提物，要得到纯化多糖甚至单一多糖还要经过一系列的纯化步骤。

1.真菌多糖粗提物的除杂

多糖粗提物中常含有杂蛋白、色素、低聚糖及一些小分子化合物等杂质，真菌多糖纯化的过程中应首先将其除去。

(1)蛋白质的去除

经典的去蛋白质方法是Sevag法，即用氯仿、正丁醇或正戊醇按5∶1混合后，加到样品水溶液中振摇，离心法除去形成凝胶状的蛋白质，反复多次至蛋白质除尽为止。该方法在实验室中最为常用，但是，其不足之处在于它的工艺流程较长、多糖损失多且有机溶剂消耗量大。

(2)色素的去除

有些真菌子实体或菌丝体中含有大量色素，这就给真菌多糖提取液的纯化带来很大困难，不仅对分光光度计的准确度有很大影响，而且还严重影响成品的品质。色素的去除常采用吸附法(纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等)、氧化法(H₂O₂)、离子交换法(DEAE－纤维素离子交换柱或Duolite A－7)、金属络合物法(费林试剂)等。

(3)其他杂质的去除

去除蛋白质和色素后的多糖液还含有较多其他杂质，可通过柱层析等方法进一步除去;而对于低聚糖、氨基酸等小分子化合物，可采用半透膜逆向流水透析法将其除去。

2.真菌多糖的分离精制

经除杂后得到的多糖液一般是由不同相对分子质量大小或不同成分的多糖混合物所组成，欲得到单一多糖就要对多糖液进行分级分离。常用于分级分离的方法主要有乙醇分级沉淀法、季铵盐沉淀法、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、膜分离法等。

3.真菌多糖的纯度鉴定

多糖的纯度鉴定一般可采用纸层析法、比旋度法、凝胶柱层析法、高压电泳法、超离心分析法、高效液相色谱法和光谱扫描法等。

(四)真菌多糖制备工艺实例

以实验室制备灵芝多糖为例，详细介绍真菌多糖的制备工艺。

1.菌种活化

将灵芝斜面种子培养基(马铃薯20%、葡萄糖2%、KH₂ PO₄ 0.2%、MgSO₄·7H₂O 0.15%、酵母膏0.5%、琼脂2%、pH5.0～5.5)配制好后分装，121℃，灭菌20min，制成斜面培养基，每支斜面接入0.5～1.0cm²菌块，27℃培养72h，灵芝菌丝均匀长满斜面。

2.摇瓶种子

将种子培养基配制好后八层纱布封口，121℃，灭菌20min，冷却至室温，将3、4块0.5～1.0cm²的斜面菌种的表层菌丝(不带培养基)接入装液量50mL/250mL的三角瓶中，27℃，160rpm培养48h。

3.发酵培养

(1)配制发酵培养基

葡萄糖3%、玉米粉3%、蛋白胨0.3%、麸皮5%、KH₂ PO₄ 0.1%、MgSO₄·7H₂O 0.05%、(NH₄)₂ SO₄ 0.2%、pH5.5。

(2)发酵培养

培养基配制好后用八层纱布封口，121℃灭菌20min，冷却至室温，将摇瓶培养得到的菌种以10%的接种量转入装液量100mL/500mL的发酵瓶中，27℃，160rpm培养至发酵终点，所得发酵液备用。

4.灵芝多糖提取

(1)胞外多糖的提取

发酵液→离心→上清液→浓缩→浓缩液→乙醇沉淀→沉淀物→丙酮、乙醚洗涤→胞外多糖

(2)胞内多糖的提取

发酵液经过离心，得到的菌丝体用80℃～90℃热水浸提，得到的上清液经过浓缩、沉淀、离心得水溶性多糖;残渣用25℃0.5mol/L NaOH浸提，离心得到的上清液为水溶性多糖;残渣再重复前面的操作，得到的上清液为水溶性多糖，最后的残渣弃掉。

5.灵芝多糖含量的测定

以苯酚－硫酸法测定总糖含量，以葡萄糖为标准，用费林法测定还原糖。

6.灵芝多糖的纯度鉴定

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤法检查纯度。

三、真菌活性多糖在食品工业中的应用

真菌多糖具有非常广泛的药理作用，尤其在免疫调节，抗肿瘤、降血糖、降血压和降血脂，延缓衰老等方面的功效，使人们越来越重视其在医疗保健领域中的研发。目前，利用真菌多糖已开发出许多产品显示出广阔的应用前景。

(一)蘑菇多糖冲剂制备工艺

1.工艺流程

蘑菇多糖→调配→混合→均质→制粒→灭菌→干燥→分装→产品

2.工艺说明

(1)配方:蘑菇多糖∶可溶性淀粉∶甜蜜素=1∶4∶0.04。

(2)制法:取蘑菇多糖等辅料分别粉碎成细粉，过20目筛，然后将多糖、可溶性淀粉、甜蜜素按1∶4∶0.04的比例均匀混合搅匀，用75%乙醇制成软材，用10目筛制粒，55℃干燥，得浅黄色颗粒，分装。

3.产品质量标准

本品为浅黄色颗粒，其水溶液澄清透亮，味甜，口感舒适。每日3次，每次一包加温开水约150mL冲服。每包20g内含蘑菇多糖1.52g。

(二)银耳红枣饮料制备工艺

1.工艺流程

2.工艺说明

(1)原料处理:用25℃～30℃的水将挑选好的银耳浸泡2～3h，至银耳充分吸水膨胀，手捏时柔软有弹性。将清洗后的银耳用不锈钢剪刀剪成3mm×4mm左右的小碎片，一方面利于浸提，另一方面也是为了增加饮料的口感风味及感官效果。将处理好的银耳碎片放入锅中加水熬煮，熬至小碎片用手指用力可捏烂，放入口中有咀嚼感。一般熬煮时间为20～25min。将熬煮好的料液过滤，可以得到银耳浸提液和银耳小碎片。对于红枣，将清洗干净的红枣沥干水分，在60℃温度下烘烤1h，继续在80℃～90℃条件下烘烤1h左右。待红枣发出焦香味将其取出晾凉，将烘烤后的红枣加适量水浸泡至枣肉膨胀，然后入锅熬煮至枣肉熟烂，用打浆机打浆。最好进行两道打浆:第1道打浆筛网孔径为0.8mm，第2道打浆筛网孔径为0.4mm。浆料过80目筛，控制加水量，使枣浆的质量分数为20%左右。

(2)配方:生产100kg饮料的原辅料配比为:银耳浸提液65.70kg，银耳小碎片10.00kg，红枣浆15.00kg，蜂蜜9.00kg，柠檬酸0.15kg，琼脂和海藻酸钠混合液0.15kg(琼脂和海藻酸钠的质量比为2∶1)。

(3)混合调配:将以上主辅料放在调配罐中，搅拌均匀后，经均质机在15～18MPa的压力下均质2次，制得均匀稳定的混合液。

(4)装瓶:将均质后的料液装入容量为250mL的透明玻璃瓶内，以增加银耳红枣饮料的感官效果。再按配方要求称取银耳小碎片装入玻璃瓶中，用封罐机封口。

(5)杀菌、冷却:将封口后的瓶装饮料放入温度为95℃～100℃的热水中常压杀菌30min，然后将其冷却。玻璃容器应采取分段冷却的方式，即100℃→80℃→60℃→40℃→室温。如果采取其他容器包装，杀菌后就可迅速冷却至常温，即得成品。

3.产品质量标准

银耳小碎片大小一致，悬浮均匀;饮料呈半透明状，性质稳定，不分层，不沉淀;色泽呈橙红色，自然美观;具有明显的枣香味和银耳香味，口感醇厚、酸甜适中。