食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法很多，有离子色谱法、比色法、示波极谱法、气相色谱法荧光法和离子选择电极法等。

1.离子色谱法

1)原理

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器检测。以保留时间定性，外标法定量。

2)试剂和材料

①超纯水: 电阻率＞18.2MΩ·cm。

②乙酸(CH3COOH): 分析纯。

③氢氧化钾(KOH): 分析纯。

④乙酸溶液(3%): 量取乙酸3m L于100m L容量瓶中，以水稀释至刻度，混匀。

⑤亚硝酸根离子(NO-2)标准溶液(100mg/L，水基体)。

⑥硝酸根离子(NO-2)标准溶液(1000mg/L，水基体)。

⑦亚硝酸盐(以NO-2计，下同)和硝酸盐(以NO-2计，下同)混合标准使用液。准确移取亚硝酸根离子(NO-2)和硝酸根离子(NO-2)的标准溶液各1.0m L于100m L容量瓶中，用水稀释至刻度，此溶液每1L含亚硝酸根离子1.0mg和硝酸根离子10.0mg。

3)仪器和设备

①离子色谱仪: 电导检测器，配有抑制器，高容量阴离子交换柱，50μL定量环。

②食物粉碎机。

③超声波清洗器。

④离心机: 转速≥10000转/分钟，配5m L或10m L离心管。

⑤0.22μm水性滤膜针头滤器。

⑥净化柱: C18柱、Ag柱和Na柱或等效柱。

注: 所有玻璃器皿使用前均需依次用2mol/L氢氧化钾和水分别浸泡4h，然后用水冲洗3～5次，晾干备用。

4)分析步骤

(1)试样预处理

①新鲜蔬菜、水果: 将试样用去离子水洗净，晾干后，取可食部切碎混匀。将切碎的样品用四分法取适量，用食物粉碎机制成匀浆备用。如需加水应记录加水量。

②肉类、蛋、水产及其制品: 用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆备用。

③乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品(不包括干酪): 将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。

④发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品: 通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。

⑤干酪: 取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失，研磨过程中应避免产生过多的热量。

(2)提取

①水果、蔬菜、鱼类、肉类、蛋类及其制品等: 称取试样匀浆5g(精确至0.01g，可适当调整试样的取样量，以下相同)，以80m L水洗入100m L容量瓶中，超声提取30min，每隔5min振摇一次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000转/分钟离心15min，上清液备用。

②腌鱼类、腌肉类及其他腌制品: 称取试样匀浆2g(精确至0.01g)，以80m L水洗入100m L容量瓶中，超声提取30min，每5min振摇一次，保持固相完全分散。于75℃水浴中放置5min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000转/分钟离心15min，上清液备用。

③乳: 称取试样10g(精确至0.01g)，置于100m L容量瓶中，加水80m L，摇匀，超声波处理30min，加入3%乙酸溶液2m L，于4℃放置20min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，取上清液备用。

④乳粉: 称取试样2.5g(精确至0.01g)，置于100m L容量瓶中，加水80m L，摇匀，超声30min，加入3%乙酸溶液2m L，于4℃放置20min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，取上清液备用。

⑤取上述备用的上清液约15m L，通过0.22μm水性滤膜针头滤器、C18柱，弃去前面3m L(如果氯离子大于100mg/L，则需要依次通过针头滤器、C18柱、Ag柱和Na柱，弃去前面7m L)，收集后面的洗脱液待测。固相萃取柱使用前需进行活化，如使用On Guard IIRP柱(1.0m L)、On Guard II Ag 柱(1.0 m L)和On Guard II Na 柱(1.0 m L)，其活化过程为:On Guard IIRP柱(1.0m L)使用前依次用10m L甲醇、15m L水通过，静置活化30min。On Guard IIAg柱(1.0m L)和On Guard IINa柱(1.0m L)用10m L水通过，静置活化30min。

(3)参考色谱条件

①色谱柱: 氢氧化物选择性，可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换柱，如Dionex Ion Pac AS11-HC4mm×250mm(带Ion Pac AG11-HC型保护柱4mm×50mm)，或性能相当的离子色谱柱。

②淋洗液: 一般试样: 氢氧化钾溶液，浓度为6～70mmol/L; 洗脱梯度为6 mmol/L 30min，70mmol/L5min，6mmol/L5min; 流速1.0m L/min。

粉状婴幼儿配方食品: 氢氧化钾溶液，浓度为5 mmol/L～50 mmol/L; 洗脱梯度为5mmol/L33min，50mmol/L5min，5mmol/L5min; 流速1.3m L/min。

③抑制器: 连续自动再生膜阴离子抑制器或等效抑制装置。

④检测器: 电导检测器，检测池温度为35℃。

⑤进样体积: 50μL(可根据试样中被测离子含量进行调整)。

(4)测定

①标准曲线: 移取亚硝酸盐和硝酸盐混合标准使用液，加水稀释，制成系列标准溶液，含亚硝酸根离子浓度为0.00mg/L，0.02mg/L，0.04mg/L，0.06mg/L，0.08mg/L，0.10 mg/L，0.15 mg/L，0.20 mg/L; 硝酸根离子浓度为0.0 mg/L，0.2 mg/L，0.4 mg/L， 0.6mg/L，0.8mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，2.0mg/L的混合标准溶液，从低到高浓度依次进样。得到上述各浓度标准溶液的色谱图(图11-2)。以亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度(mg/L)为横坐标，以峰高(μs)或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算线性回归方程。

②样品测定: 分别吸取空白和试样溶液50μL，在相同工作条件下，依次注入离子色谱仪中，记录色谱图。根据保留时间定性，分别测量空白和样品的峰高(μs)或峰面积。

5)计算

图11－2 亚硝酸盐和硝酸盐混合标准溶液的色谱图

式中: X——试样中亚硝酸根离子或硝酸根离子的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);

c——测定用试样溶液中的亚硝酸根离子或硝酸根离子浓度，单位为毫克每升(mg/L);

c0——试剂空白液中亚硝酸根离子或硝酸根离子的浓度，单位为毫克每升(mg/L);

V——试样溶液体积，单位为毫升(m L);

f——试样溶液稀释倍数;

m——试样取样量，单位为克(g)。

6)说明

试样中测得的亚硝酸根离子含量乘以换算系数1.5，即得亚硝酸盐(按亚硝酸钠计)含量; 试样中测得的硝酸根离子含量乘以换算系数1.37，即得硝酸盐(按硝酸钠计)含量。

2.分光光度法

1)原理

亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，硝酸盐采用镉柱还原法测定。

试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，用外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，用此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。

2)试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的二级水或去离子水。

①锌皮或锌棒。

②硫酸镉。

③亚铁氰化钾溶液(106g/L): 称取106.0g亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6·3H2O)，用水溶解，并稀释至1000m L。

④乙酸锌溶液(220g/L): 称取220.0g乙酸锌(Zn(CH3COO)2·2H2O)，先加30m L冰醋酸溶解，用水定容至1000m L。

⑤饱和硼砂溶液(50g/L): 称取5.0g硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)，溶于100m L热水中，冷却后备用。

⑥氨缓冲溶液(p H9.6～9.7): 量取30m L盐酸，加100m L水，混匀后加65m L氨水(25%)，再加水稀释至1000m L，混匀。调节p H至9.6～9.7。

⑦氨缓冲液的稀释液: 量取50m L氨缓冲溶液，加水稀释至500m L，混匀。

⑧盐酸(0.1mol/L): 量取5m L盐酸(ρ=1.19g/m L)，用水稀释至600m L。

⑨对氨基苯磺酸溶液(4g/L): 称取0.4g对氨基苯磺酸(C6H7NO3S)，溶于100m L20% (V/V)盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。

⑩盐酸萘乙二胺溶液(2g/L): 称取0.2g盐酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl)，溶于100m L水中，混匀后，置棕色瓶中，避光保存。

亚硝酸钠标准溶液(200μg/m L): 准确称取0.1000g于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解，移入500m L容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

亚硝酸钠标准使用液(5.0μg/m L): 临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00m L，置于200 m L容量瓶中，加水稀释至刻度。

3)仪器和设备

①天平: 感量为0.1mg和1mg。

②组织捣碎机。

③超声波清洗器。

④恒温干燥箱。

⑤分光光度计。

⑥镉柱。

a.海绵状镉的制备: 投入足够的锌皮或锌棒于500 m L 硫酸镉溶液(200 g/L) 中，经过3～4h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾泻法多次洗涤，然后移入组织捣碎机中，加500m L水，捣碎约2s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取20～40目之间的部分。

图11－3 镉柱示意图

1—贮液漏斗，内径35mm，外径37mm; 2—进液毛细管，内径0.4mm，外径6mm;3—橡皮塞; 4—镉柱玻璃管，内径12mm，外径15 mm; 5，7—璃棉;6—海绵状镉;8—出液毛细管，内径2mm，外径8mm

b.镉柱的装填: 如图11-3。用水装满镉柱玻璃管，并装入2cm高的玻璃棉做垫，将玻璃棉压向柱底时，应将其中所包含的空气全部排出，在轻轻敲击下加入海绵状镉至8～10cm高，上面用1cm高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗，末端要穿过橡皮塞与镉柱玻璃管紧密连接。

如无上述镉柱玻璃管时，可以25m L酸式滴定管代用，但过柱时要注意始终保持液面在镉层之上。

当镉柱填装好后，先用25m L0.1mol/L盐酸洗涤，再以水洗两次，每次25m L，镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。

③镉柱每次使用完毕后，应先以25m L盐酸(0.1mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次25m L，最后用水覆盖镉柱。

④镉柱还原效率的测定: 吸取20m L硝酸钠标准使用液，加入5m L氨缓冲液的稀释液，混匀后注入贮液漏斗，使流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当贮液漏斗中的样液流完后，再加5m L水置换柱内留存的样液。取10.0m L还原后的溶液(相当10μg亚硝酸钠)于50m L比色管中，以下按“离子色谱法中(4) ①”自“吸取0.00m L，0.20m L，0.40m L，0.60 m L，0.80m L，1.00m L……”起依法操作，根据标准曲线计算测得结果，与加入量一致，还原效率应大于98%为符合要求。

⑤还原效率计算，按式(11-12)进行计算:

式中: X——还原效率，%;

A——测得亚硝酸钠的含量，单位为微克(μg);

10——测定用溶液相当亚硝酸钠的含量，单位为微克(μg)。

4)分析步骤

(1)试样的预处理

同“离子色谱法”。

(2)提取

称取5g(精确至0.01g)制成匀浆的试样(如制备过程中加水，应按加水量折算)，置于50m L烧杯中，加12.5m L饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300m L将试样洗入500m L容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。

(3)提取液净化

在振荡上述提取液时加入5m L亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5m L乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30m L，滤液备用。

(4)亚硝酸盐的测定

吸取40.0m L上述滤液于50m L带塞比色管中，另吸取0.00m L、0.20m L、0.40m L、0.60m L、0.80m L、1.00m L、1.50m L、2.00m L、2.50m L亚硝酸钠标准使用液(相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亚硝酸钠)，分别置于50m L带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2m L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后各加入1m L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。

(5)硝酸盐的测定

①镉柱还原: 先以25m L稀氨缓冲液冲洗镉柱，流速控制在3～5m L/min(以滴定管代替的可控制在2～3m L/min)。吸取20m L滤液于50m L烧杯中，加5m L氨缓冲溶液，混合后注入贮液漏斗，使流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当贮液漏斗中的样液流尽后，再加5m L水置换柱内留存的样液。将全部收集液如前再经镉柱还原一次，第二次流出液收集于100m L容量瓶中，继以水流经镉柱洗涤三次，每次20m L，洗液一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混匀。

②亚硝酸钠总量的测定: 吸取10～20m L还原后的样液于50m L比色管中。以下按“离子色谱法中(4) ①”自“吸取0.00m L，0.20m L，0.40m L，0.60m L，0.80m L，1.00m L……”起依法操作。

5)计算

(1)亚硝酸盐含量计算

亚硝酸盐(以亚硝酸钠计)的含量按式(11-13)进行计算。

式中: X1——试样中亚硝酸钠的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);

A1——测定用样液中亚硝酸钠的质量，单位为微克(μg);

m——试样质量，单位为克(g);

V0——试样处理液总体积，单位为毫升(m L);

V1——测定用样液体积，单位为毫升(m L)。

(2)硝酸盐含量计算

硝酸盐(以硝酸钠计)的含量按下式(11-14)进行计算。

式中: X2——试样中硝酸钠的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);

A2——经镉粉还原后测得总亚硝酸钠的质量，单位为微克(μg);

m——试样的质量，单位为克(g);

1.232——亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数;

V2——测总亚硝酸钠的测定用样液体积，单位为毫升(m L);

V0——试样处理液总体积，单位为毫升(m L);

V3——经镉柱还原后样液总体积，单位为毫升(m L);

V4——经镉柱还原后样液的测定用体积，单位为毫升(m L);

X1——试样中亚硝酸钠的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)。

3.示波极谱法

1)原理

样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8-羟基喹啉偶合形成橙色染料，该偶氮染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐的浓度呈线性关系，可与标准曲线比较定量。

2)试剂

①8 g/L对氨基苯磺酸溶液: 称取2.00 g对氨基苯磺酸，用热水溶解，再加25 m L 1.0mol/L盐酸，移至250m L容量瓶稀释至刻度。

②1g/L8-羟基喹啉溶液: 称取0.250g8-羟基喹啉，加4.00m L0.1mol/L盐酸和水溶解，移至250m L容量瓶稀释至刻度。

③0.10mol/LEDTA溶液: 称取3.722g EDTA(C10H14N2O4Na·2H2O)，加水30m L溶解，转入100m L容量瓶中用水稀释至刻度。

④氨水(5%): 吸取28%的浓氨水5.00m L于100m L容量瓶中，加水稀释至刻度。

⑤亚硝酸钠标准使用液: 准确吸取亚硝酸钠标准溶液5.00m L于200m L容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5μg亚硝酸钠。再取10.00m L该稀释液于100m L容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.5μg的亚硝酸钠。

其他试剂与比色法相同。

3)仪器

示波极谱仪。

4)操作方法

(1)样品处理

称取经绞碎混匀的样品5.00g(午餐肉、火腿肠可称10.00～20.00g)，以下按“分光光度法中4)(2)”自“置于50m L烧杯中……”起依法操作。

(2)提取净化

同“分光光度法中4)(3)”。

(3)测定

吸取3m L上述溶液于10m L容量瓶(或比色管)中，另取0.00m L，0.50m L，1.00m L， 1.50m L，2.00m L，2.50m L，3.00m L亚硝酸钠标准溶液(相当于0.00g，0.25μg，0.50μg， 0.75μg，1.00μg，1.25μg，1.5μg亚硝酸钠)于10m L容量瓶(比色管)中，于标准与样品管中分别加入0.20m L0.10mol/LEDTA，1.50m L8g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～4min后各加入1.00m L1g/L8-羟基喹啉溶液和0.5m L氨水(5%)，用水稀释至刻度，混匀，静置10～15min，将试液全部转入电解池中(10m L小烧杯)。在示波极谱仪上采用三电极体系进行测定(滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极)。

测定参考条件: 原点电位调节在-0.20V; 倍率为0.1(可以根据试样中亚硝酸盐含量多少选择合适的倍率，含量高，倍率选择在0.1以上; 反之，倍率选择在0.1以下); 电极开关拨至三电极; 导数档; 测量开关拨至阴极。将三电极插入电解池中，每隔7s仪器自行扫描一次，在荧光屏上记录-0.56V左右(允许电位波动10～20m V)的极谱波高，绘制标准曲线比较。

5)计算

式中: X——试样品中亚硝酸盐的含量，单位为克每千克(g/kg);

A——测定用样液中亚硝酸盐的质量，单位为微克(μg);

m——试样质量，单位为克(g);

V1——试样溶液的总体积，单位为毫升(m L);

V2——测定用样液体积，单位为毫升(m L)。