亚硝酸盐法

13．3．2　亚硝酸盐法

用亚硝酸盐、氰化钾抑制区别法测定样品中的Cu，Zn－SOD和Mn－SOD，灵敏度高，重现性好，操作简便。实验表明，抑制率达50%时所需SOD的浓度为0．07μg/mL。

13．3．2．1　测定原理

13．3．2．2　实验方法

（1）仪器与试剂：黄嘌呤氧化酶（XOD，BR）；次黄嘌呤（含量＞99%）；对氨基苯磺酸（GR）；萘乙二胺（含量＞99%）等。

（2）试剂配制及粗酶液的制备：①试剂A：含0．6mmol/L硫酸羟胺和0．6mmol/L次黄嘌呤。②试剂B：含10．0mu/mL XOD。③试剂C：含0．43mg/mL对氨基苯磺酸，26．7%乙酸及0．048mg/mL萘乙二胺。④缓冲液：含62．4mmol/L磷酸二氢钾及46．8mmol/L四硼酸钠，pH为8．2。⑤KCN溶液：含3mmol/L KCN，62．4mmol/L磷酸二氢钾，46．8mmol/L四硼酸钠，pH为8．2。⑥粗酶液：取新鲜鸡肝，按Weisigen－Fridovich方法经匀浆、冷冻离心、超声波破碎等步骤制备。

13．3．2．3　活性测定方法

（1）将试管编号，按表13－6依次加入样品及各种试剂，然后进行活性测定。表中待测样品和缓冲液量可根据样品中的SOD量相应增减，一般0号管的吸光度应控制在0．2～0．4左右。

表13－6　SOD的活性测定

随后各加试剂a 1．0mL，混匀，37℃下保温5min；再各加试剂B　0．5mL，勿摇，37℃下保温20min；最后各加试剂C 5．0mL，混匀，室温放置30min，读出550nm处的吸光度。

（2）活性计算：先计算各测定管的抑制率。

然后以抑制率为纵坐标，样品的稀释度为横坐标，在半对数坐标纸上作图（图13－1），图中50%抑制率所对应的稀释度即为样品SOD的活性单位数。也可将各吸收度及对应的稀释度输入计算机，以HGR方式标绘出各实验点，进行一元线性回归，打印出图形、SOD活性单位数、相关系数和估计标准偏差。

（3）标准抑制曲线的绘制。用标准Cu，Zn－SOD绘制SOD抑制曲线，见图13－1。由于测定体系的反应体积为3mL，故达到50%抑制率所需的浓度为0．07μg/mL。

图13－1　SOD抑制曲线