原代肾小球内皮细胞的分离培养

（一）实验目的

肾小球内皮细胞是肾组织重要的固有细胞，广泛参与了肾组织的炎症、增殖和硬化的发生。肾小球内皮细胞的进行性丢失是进展性肾病的特征性变化。掌握原代肾小球内皮细胞的体外培养技术对于解析肾脏病发生、进展机制具有重要意义。

（二）实验试剂

1.20%FBSRPMI1640培养基。

2.Ⅴ型胶原酶（0.5mg/ml）。

3.内皮细胞培养液　20%FBS RPMI1640中含有：Insulin（5μg/ml），硒（Selenium，5ng/ml），Transferrin（3μg/ml），肝素（Heparin，5U/ml），成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF，2ng/ml）。

（三）实验流程

1.取肾脏组织，4℃生理盐水冲洗，剥离肾包膜，用剪刀把肾皮质剪成碎块。

2.将研磨组织放入重叠不锈钢筛网（孔径为250μm，106μm，75μm）。

3.在最上层（250μm）筛网上用消毒针筒内蕊轻压肾皮质，同时用4℃生理盐水轻轻冲洗，滤入第二层筛网中（106μm）。

4.继续用生理盐水冲洗第二层筛网，同时轻研组织，滤过第三层筛网中（75μm）。

5.在第三层滤器上吸出少许组织，镜下观察，若只有纯净小球而几乎不含小管即可停止冲洗，（肾小球纯度>95%），收集此层组织移入离心管。

6.离心弃上清，酌情加入2～3mlⅤ型胶原酶充分混匀后入37℃孵箱15min，边消化边观察，首先使肾小球从包曼氏囊中剥离，终止消化，离心分离肾小球，继续置Ⅴ型胶原酶中消化，细胞散出但又不破碎为适度。

7.用10%FBS RPMI1640终止消化，800r离心2～5min，上清移至其他离心管，1500r离心10min，取沉淀混匀分散后加入内皮细胞培养液，计数后分瓶入37℃CO2孵箱内培养。

（四）肾小球内皮细胞鉴定

1.由于目前的细胞鉴定方法单一，选择不尽全面，宜用多种方法检测然后综合分析，表1-2从不同方面列举了肾小球内皮细胞的特性。

表1-2　肾小球内皮细胞的特性

国外研究显示，利用相差显微镜能够观察到肾小球内皮细胞由多个多边形细胞组成了一个单细胞层。形态学上与上皮相似，但是明显不同于肾小球系膜细胞。如果把血清降至2%，它们将处于静止状态。72～96h后，大部分细胞从壁上脱落，剩余的细胞延伸出毛细血管样的结构。目前在类似毛细血管结构中出现的开窗式结构还没有报道。内皮细胞开窗式结构形成需要特定的条件，开窗结构的出现伴随着细胞融合数量的增加。

利用电子显微镜发现，单层内皮细胞之间有紧密连接、细胞内有丰富的细胞骨架和微管及微细纤维、大量的线粒体和发育良好的高尔基体以及怀布尔-帕拉德体（Weibel-Palade body，内皮细胞特征小体）。细胞表面可以观察到稀少的微绒毛。培养的肾小球内皮细胞Ⅷ因子相关抗原染色阳性。

2.鉴定肾小球内皮细胞的方法

（1）形态学鉴定：光镜观察，生长活跃的内皮细胞体积中等，为扁平的多边形、卵圆形或纺锤形，大小均匀。胞核清晰，多居中央，呈圆形和椭圆形。少部分细胞胞质形成细长突起，似毛细血管样。生长成片后的内皮细胞成单层“铺路石样”镶嵌排列生长，并有接触抑制现象，见图1-2。

（2）间接免疫荧光鉴定：选择生长最佳时期的肾小球内皮细胞，然后分别加入抗Ⅷ因子、相关抗原、结蛋白、细胞角蛋白、Ⅳ型胶原、纤维连结蛋白、层黏连蛋白抗体，免疫荧光染色后观察。肾小球内皮细胞Ⅷ因子免疫荧光染色阳性，结果见图1-3。

图1-2　原代培养的肾小球内皮细胞（×200）

图1-3　肾小球内皮细胞Ⅷ因子染色阳性（×400）

（3）肾小球内皮细胞与其他细胞的鉴别：利用间接免疫荧光进行鉴定，以同期培养的来自同一肾脏的系膜细胞作对照，鉴定结果见表1-3。内皮细胞的第Ⅷ因子相关抗原染色为阳性，而结蛋白、角蛋白、细胞角蛋白均为阴性。系膜细胞Ⅷ因子相关抗原为阴性，结蛋白为阳性。

表1-3　肾小球内皮细胞和系膜细胞的鉴别

（四）注意事项

1.人、大鼠、小鼠肾脏取材一定保证是新鲜组织。

2.要严格无菌操作。

3.根据组织的不同来源进行筛网的选择，成人、大鼠、小鼠各不相同，酌情而定。

4.在实验过程中，研磨的力度不能太重，太重会把肾小球磨碎，又不能太轻，过轻将导致块状组织太多。

5.消化时间要掌握好，一般Ⅴ型胶原酶取0.5mg/ml，37℃15min，一定要镜下不断观察。

6.离心转速要掌握好条件，每次实验要严格操作，如果离心转速太低，会导致内皮细胞收集不纯；转速太大，会丢失一部分内皮细胞。

7.由于内皮细胞比较娇嫩，在选择瓶皿时最好选用塑料培养瓶，同时明胶包被。

8.定期观察细胞，但切记太过频繁，以免影响细胞正常生长状态。

相对于成人肾小球内皮细胞培养来说，大鼠肾小球内皮细胞的分离培养取材更方便、快捷，实验中如有条件最好通过灌注泵进行原位灌洗。不经灌洗的肾小球因其中含有大量的血细胞，致使肾小球贴壁慢，甚至不贴壁。而经灌洗后培养的细胞生长状态较好。

参考文献

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