分离条件的选择

1. 色谱柱分离度

色谱柱分离混合物的能力用柱效能（柱效）来表示。 在一定条件下， 色谱柱的柱效可用塔板数n或塔板高度H来衡量。在塔板理论中，有效塔板数n有效或有效塔板高度H有效比理论塔板数n或理论塔板高度H更能真实地反映色谱柱的分离能力， 它们的计算公式见式（5-1）、 式（5-2）和式（5-3）：

t′R＝t R－t M（5-3）

式中，t′R为组分的调整保留时间；W1／2为色谱峰的半峰宽；Wb为色谱峰的峰底宽；t M为空气或甲烷的保留时间（死时间）； L为色谱柱的长度。

分离度（resolution，R）是指相邻两组分色谱峰保留时间之差与两组分色谱峰的基线宽度总和之半的比值。 分离度用分离方程式（5-4）表示：

R≥1.5时， 两组分才能完全分离。

分离度与柱效（n）， 分配系数比（α）及容量因子（k）的关系式见式（5-5）：

式中，n为柱效项；α为柱选择项；k2为柱容量项。

k、 n、 α对色谱峰的影响如下（图5-2）：

增加k， 分离度增加， 峰明显变宽；

增加n， 峰变窄， 但分离度有所改善；

增加α， 分离度增加， 峰宽度不变。

图5－2 容量因子（k）、 柱效（n）及分配系数比（α）对分离度（R）的影响

由分离方程式选择实验条件：

（1） 提高α。

α取决于试样中各组分本身的性质， 以及固定相和流动相。 α越大， 固定液的选择性越好， R越大。 α＝1， R＝0， 两组分不可能分离。

提高α的方法如下：

①改变固定相和流动相的组成和性质；

②降低柱温。

（2） 提高容量因子k， k大， R大。

k与固定液的用量和分配系数有关， 并受柱温的影响。 增加固定液的用量， 可增大R，但会延长分析时间， 引起色谱峰展宽。

提高k的措施如下：

通过改变柱温和流动相组成， 将k值控制为2～10。

（3） 提高n。

如提高柱效n， 需增加色谱柱的长度L、 减小塔板高度H、 提高分离度R。 措施如下：

①制备一根性能优良的色谱柱；

②改变流动相的流速和黏度和吸附在载体上的液膜厚度， 减小H， 增大R。

2. 载气及其流速的选择

Van Deemter通过实验发现， 在载气流速很低时， 峰变锐； 超过某一速度后， 流速增加，峰变钝。 用塔板高度H对载气流速u作图（二次曲线）。 曲线最低点对应的板高最小， 柱效最高， 此时的流速称为最佳流速， 如图5-3所示。

图5－3 塔板高度H和载气流速的关系曲线示意

Van Deemter根据气相色谱过程中的物料平衡、 扩散及传质现象与溶质运动速率关系的偏微分方程， 假设：

（1） 纵向扩散是造成谱带展宽的重要原因， 必须予以考虑；

（2） 传质阻力是造成谱带展宽的主要原因， 它使平衡成为不可能；

（3） 对填充柱有涡流扩散的影响。

在气相色谱中， 固定液、 柱温及载气的选择是分离条件选择的3个主要方面， 用于提高柱效、 降低塔板高度、 提高相邻组分的分离度。 在进行定量分析时， 要求组分能分离完全（R≥1.5）， 这样才能获得较高的精密度和准确度。

根据范氏方程：

H ＝A＋B／u＋Cu （5-7）

在曲线的最低点，塔板高度H最小，此时柱效最高。该点所对应的流速为最佳流速u最佳。

u最佳及H最佳可由式（5-8）微分求得：

即

H最小＝A＋2 BC （5-10）

当时， 分子扩散项为主， 采用分子量大的载气如氮气、 氩气， 减小扩散系数， 提高柱效。

当时， 传质阻力项为主， 选用分子量较小的气体， 如氢气、 氦气， 使组分有较大的扩散系数， 提高柱效。

通常u最佳实用＞u最佳，载气的选择还应与检测器匹配。

3. 柱温的选择

柱温是一个重要参数， 直接影响分离效能和分析速度。

柱温升高的影响如下：

（1） 提高分析速度， 缩短分析时间；

（2） 使气液传质速率加快， 可降低塔板高度， 改善柱效。

（3） 高于固定液 “最高使用温度”， 会造成柱流失。

（4） 加剧纵向扩散， 降低柱效。

柱温降低的影响如下：

（1） 增大分配系数， 增加柱选择性；

（2） 降低气相扩散， 减少固定液流失；

（3） 延长柱寿命， 降低检测本底。

柱温降低的缺点如下：

（1） 增加分析时间；

（2） 液相传质阻抗增加， 峰扩张， 严重时引起拖尾。

选择柱温的原则如下：

在使难分离的物质得到良好的分离、 分析时间适宜， 并且峰形不拖尾的前提下， 尽可能采用低柱温。 对于宽沸程的混合物， 采取程序升温通常根据试样的沸点选择柱温、 固定液用量及载体的种类（表5-1）。

表5－1 根据试样沸点选择柱温等条件

注： 固定液用量为固定液： 载体。

程序升温是指按预先设定的加热速度对色谱柱分期加热以使混合物中所有的组分均能在最佳温度下获得良好的分离。 程序升温可以是线性的， 也可以是非线性的。

4. 柱长和内径的选择

分离度正比于柱长的平方根， 见式（5-11）：

所以增加柱长对分离有利， 但增加柱长会使各组分的保留时间增加， 延长分析时间。 因此， 在满足一定分离度的条件下， 应尽可能使用较短的色谱柱。 填充柱柱长为2～4m。

增加色谱柱的内径， 可以增加分离的样品量， 但纵向扩散路径的增加会使柱效降低。 柱内径为4～6mm。

5. 进样时间和进样量

（1） 进样时间： 进样速度必须很快， 因为当进样时间太长时， 试样原始宽度将变大，色谱峰半峰宽随之变宽， 有时甚至使峰变形。 一般的， 进样时间应在1s以内。

（2） 进样量：

①每根柱子都有最大允许进样量。

②进样量过大， 会造成色谱柱超负荷， 柱效下降， 峰形变宽， 保留时间改变。

③最大允许进样量应控制在使峰面积和峰高与进样量呈线性关系的范围内， 对于液体试样一般进样0.1～0.2μL。

6. 其他条件

（1） 气化室温度：

①气化室温度应等于或稍高于样品的沸点， 以保证迅速气化， 通常高于柱温30℃～50℃， 否则色谱峰展宽， 峰高下降。

②汽化室温度过高， 会导致样品分解。

（2） 检测器温度：

①高于柱温30℃～50℃或等于气化室温度。

②TCD： 高于柱温， 温度升高灵敏度下降， 温度应稳定。

③FID：100℃以上， 对温度要求不高。

④ECD： 温度对基流和峰高影响很大， 但应具体样品具体分析。

[1] 1英寸＝0.0254米。