样品的性质与色谱分离模式的选择

样品的溶解度、分子量大小、分子结构及分析特性等理化性质决定了其色谱分离模式的选择。在建立HPLC分析方法前，应对样品的上述性质进行深入了解。

4.3.1.1　溶解度

若样品溶解于非极性溶剂中，表明样品为非极性化合物，可用戊烷、己烷、庚烷等溶解，通常选用吸附色谱法或正相分配色谱法、正相键合相色谱法进行分析。若样品溶解于极性溶剂中(如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等)，则表明样品为极性化合物，通常选择反相色谱法或反相键合相色谱法进行分析。若样品溶于水，可通过其水溶液的pH判断样品的离子强度，如果样品为中性或非离子型，可用反相键合相色谱法分析。若pH为弱酸性，可在流动相中加入H2 SO4、H3 PO4等试剂抑制样品电离，再采用反相键合相色谱法分析;若pH为弱碱性，可在流动相中加入阳离子，再用离子对色谱法进行分析;若pH为强酸或强碱，则可通过离子色谱法进行分析。

4.3.1.2　分子量

对于分子量小于2000 Da的水溶性样品可采用吸附色谱法或分配色谱法进行分析，若样品分子量差别较大，可通过刚性凝胶的凝胶过滤色谱法进行分离;对于分子量大于2000 Da的水溶性样品，可采用以聚醚为基体凝胶的凝胶过滤色谱法进行分析。

图4－3　高效液相色谱法分离模式选择示意图

4.3.1.3　分子结构

通常对于分子结构完全不同的化合物，通过选择合适的色谱分离方法及流动相比例即可得到较好的分离效果。对特殊结构化合物的分离还应注意以下事项:

(1)同系物的分离:具有相同官能团的同系物具有分子量递增的规律，可采用吸附色谱法、分配色谱法或键合相色谱法进行分离。同系物随分子量增加保留时间增长。

(2)同分异构体:对于双键位置异构体(顺反异构体)或芳香族取代基位置不同的邻、间、对位异构体，采用吸附色谱法进行分离具有较好的效果，因为硅胶吸附剂对异构体具有高选择性。

(3)对映异构体:普通的高效液相色谱法无法对对映异构体进行分离，此时应考虑使用具有光学活性的固定相或在流动相中加入手性选择剂进行分离。

(4)生物大分子:目前对像蛋白质、核酸等生物大分子的分离分析已逐渐成为体内药物分析领域的热点，由于此类物质具有大分子量的特点(分子量在10000 Da以上)，因此，其扩散系数要比小分子物质低1～2个数量级。对该类物质采用凝胶过滤色谱法或亲和色谱法可得到较好的分离效果。

在各种色谱分离模式中，反相键合相色谱法的应用最为广泛，通过C18色谱柱，以甲醇－水或乙腈－水作为流动相，经梯度洗脱，往往能获得较满意的分离结果。此外，其他色谱分离模式，如液固色谱法、体积排阻法、离子色谱法等在药物分析的工作中也得到了广泛应用，各种类型的HPLC方法的应用见表4－3。

表4－3　HPLC分离模式、流动相、色谱柱选择及应用范围