纸色谱法（甘氨酸-亮氨酸的分离与鉴定）

实验十二　纸色谱法（甘氨酸-亮氨酸的分离与鉴定）

一、实验目的

1．掌握纸层析原理和操作技术。

2．分离与鉴定氨基酸。

二、基本原理

纸色谱是将滤纸作为载体，吸附在滤纸上的水作为固定相，而有机溶剂作为流动相，把样品点在滤纸上，用展开剂展开时，借滤纸纤维的毛细现象，使展开剂向上移动，相当于用展开剂对水相中的样品连续不断地提取，由于样品中各组成在固定相和移动相的分配系数不同，在固定相中溶解度大的，随移动相移动就慢一些，移动的距离就小一点，反之在移动相中溶解度较大的，随移动相移动的速度快一些，移动的距离就大一些，这样样品各成分在两相中经过反复多次的分配而达到分离的目的。

三、仪器和试剂

1．仪器

层析缸　　　　　　　　　　　毛细管（内径为0.5mm）

7.5cm×15cm标本缸　　　　　 喷雾器

层析纸新华1号（5cm×14cm）　铅笔

直尺

2．试剂

0.1%甘氨酸水溶液　　　0.1%亮氨酸水溶液

0.1%茚三酮乙醇溶液　　正丁醇

甲酸　　　　　　　　　未知液

四、实验步骤

1．层析纸的准备

将活化^[1]的一张5cm×14cm的层析纸条，在离底边1.5cm处用铅笔^[2]画一直线作为起始线，在起始线上画上A、B、C三个点，各点之间的距离为1.5cm，A、C两点分别离层析纸边为1cm，在起始线7cm处画一直线作为溶剂前沿线^[3]，如图3-18所示。

2．点样

取内径约0.5mm的毛细管三小段，分别插入试样溶液中，借毛细虹吸现象吸取溶液少许，在A上点样甘氨酸溶液，B上点样未知液，C上点样亮氨酸溶液，样点的直径为2～3mm，如溶液太稀，第一次点样、吹干后，再点样第二、第三次，每次都要点在同一位置上（点样的次数视样品的浓度而定）。

3．展开

将30mL展开剂（正丁醇∶甲酸∶水=5∶3∶2，体积之比）倒入层析缸中，盖上盖子，饱和20分钟后^[4]，再将点好样品的层析纸上端用回形针别住，把层析纸悬挂在层析缸盖的钩上，使层析纸的底边浸入展开剂0.5cm，如图3-19所示。要求滤纸在层析缸内为：垂直、悬挂在中间。展开剂到达前沿线后，展开完毕，取出层析纸，晾干或红外灯下烘干。

4．显色

将烘干的层析纸用喷雾器喷显色剂（茚三酮乙醇溶液），再到红外灯下烘到显色为止^[5]。

5．计算各氨基酸的Rf值

如图3-20所示，描出斑点的轮廓，并找出斑点的中心距离。根据下列公式计算各氨基酸的Rf值，并将纯样品和未知样品的Rf值进行对照，鉴定未知液^[6]。

图3-18　层析纸的准备

图3-19　展开

图3-20　斑点的处理

注　解

[1]层析纸使用前，应在烘箱中干燥，具体方法为100℃温度下，烘1～2小时，否则会产生拖尾现象。

[2]画线时只能使用铅笔，不能使用其他的笔。其他笔的颜色为有机染料，在有机溶剂中染料溶解，会产生颜色干扰。

[3]无论是画线还是点样，不能用手接触层析纸前沿线以下的任何部位，因为手指上有相当量的氨基酸，足以在本实验方法中被检出，从而干扰实验结果。

[4]纸层析须在密闭容器中展开。加入展开剂后，再等20分钟左右，使层析缸内形成此溶液的饱和蒸气。

[5]喷有显色剂的层析纸，在烘干时应注意温度的控制。温度太高，不但氨基酸会产生颜色，而且茚三酮也会产生颜色，从而干扰实验结果。

[6]Rf值随分离化合物的结构、固定相与流动相的性质、温度以及纸的质量等因素变化而变化。当温度、滤纸等实验条件固定时，比移值就是一个特有的常数，因而可作定性分析的依据。