绿色植物色素的提取及色谱分离

Extration of Phytochrom from Plants and Chromatographic Separation

【目的要求】

1．学习绿色植物色素的提取原理和提取方法。

2．了解色谱分离的原理。

3．掌握柱色谱的操作技能。

【基本原理】

绿色植物的茎、叶中含有胡萝卜素(橙)、叶黄素(黄)和叶绿素(绿)等多种天然色素。

植物色素中的胡萝卜素(C40 H56)是具有长链结构的共轭多烯，有三种异构体，即α－、β－和γ－胡萝卜素。其中β－体含量较多，也最重要。生长期较长的绿色植物中，异构体中β－体的含量多达90%。β－体具有维生素A的生理活性，其结构是两分子的维生素A在链端失去两分子水结合而成的。在生物体内，β－体受酶催化氧化即形成维生素A。目前β－体亦可工业生产，可作为维生素A使用，同时也作为食品工业中的色素。

叶黄素(C40 H56O2)最早是从蛋黄中析离的，它是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

叶绿素有两个异构体:叶绿素a，C55 H72MgN4O5;叶绿素b，C55 H70MgN4O6，其差别仅是a中卟啉环上的一个甲基被甲酰基所取代形成b。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。

本实验将从菠菜叶中提取上述几种色素，并通过柱色谱分离和薄层色谱分析鉴定。

【仪器与试剂】

仪器:研钵，分液漏斗，锥形瓶，滴管，色谱柱。

试剂:绿色植物叶5．0 g，95%乙醇，石油醚(60～90℃)，丙酮，正丁醇，苯，硅胶G板，中性氧化铝。

【操作步骤】

称取5 g新鲜的绿色植物叶子(如菠菜叶)于研钵中捣烂，用30 mL 2 1的石油醚－乙醇分几次浸取。浸取液过滤，滤液转移到分液漏斗中，加等体积的水洗一次。洗涤时要轻轻振荡，以防乳化。弃去下层的水－乙醇层，石油醚层再用等体积的水洗二次，以除去乙醇和其他水溶性物质。有机相用无水硫酸钠干燥后转移到另一锥形瓶中保存。取一半经水浴蒸去大部分石油醚至体积为5 mL为止做柱色谱分离用，其余留作薄层色谱分析。

1．柱色谱分离

色谱柱的装填:将10 g中性氧化铝与10 mL石油醚搅拌成糊状，并将其慢慢加入预先加了一定石油醚的色谱柱中，同时打开活塞，让石油醚流入锥形瓶中。以稳定的速度装柱，不时用橡胶棒敲打色谱柱，使色谱柱装得均匀［1］。在装好的柱子上放0．5 cm厚的石英砂一片滤纸，并不断用石油醚洗脱，以使色谱柱流实。然后放掉过剩的石油醚，直至液面刚刚达到石英砂或滤纸的顶部，关闭活塞。

洗脱:将提取浓缩液用滴管小心地加到色谱柱顶。加完后，打开活塞，让液面刚刚达到色谱柱顶部，关闭活塞。再用滴管加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，如此反复几次，使色素全部进入柱体。待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加约1．5 cm高度的洗脱剂(9 1的石油醚－丙酮溶液)。然后在色谱柱上面装一分液漏斗，内装20 mL洗脱剂。打开上下两个活塞，让洗脱剂逐滴放出，分离即开始进行。当第一个橙黄色色带即将流出时，换一锥形瓶接收，此为胡萝卜素，约用洗脱剂50 mL(若流速慢，可用洗耳球稍加压，注意不能在柱内吸气!)。再用7 3的石油醚－丙酮洗脱，当第二个棕黄色色带即将滴出时，换一锥形瓶接收，此为叶黄素［2］。再换用3 1 1的正丁醇－乙醇－水洗脱，分别接收叶绿素a(蓝绿色)和叶绿素b(黄绿色)。

2．薄层色谱分析

在10 cm×3 cm的硅胶G板［3］上，用分离后的胡萝卜素点样，7 3的石油醚－丙酮展开，可出现1～3个黄色斑点。用分离后的叶黄素点样，7 3的石油醚－丙酮展开，一般可呈现1～4个点。取2块硅胶G板，一边点色素提取液样点，另一边分别点柱色谱分离后的4个试液，用8 2的苯－丙酮展开，或用6 4的石油醚－乙酸乙酯展开，观察斑点的位置，并依R f由大到小的次序将胡萝卜素、叶黄素和叶绿素排列出来。

本实验约需6 h。

【注释】

［1］装好的柱子不能有裂缝和气泡。

［2］叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿植物叶得到的提取液中，叶黄素含量少，柱色谱中不易分出黄色带。

［3］硅胶G板可参照“实验9薄层色谱”中的方法自行制备。

实验指导

【预习要求】

1．了解绿色植物色素的提取原理和提取方法。

2．温习色谱分离的原理及柱色谱和薄层色谱的基本操作。

【思考题】

试比较胡萝卜素、叶黄素和叶绿素的极性，为什么胡萝卜素在色谱中移动最快?

(编写:蒋新宇　校核:王微宏)