糖化酶的分离提取及性质分析

任务3　糖化酶的分离提取及性质分析

一、糖化酶的分离提取

成品糖化酶可分为液体酶和固体酶两种。固体酶的制备方法可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和吸附法等，采用一条合理的提取工艺，可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成品的成本，具体流程如图6－13所示。

图6－13　糖化酶固体酶提取制备工艺流程

目前国内对液体酶产品采用的浓缩方法有两种，一种为依靠热源来蒸发产品中的水分，另一种为利用渗透膜超滤除去产品中的水分。比较上述两种方法，前者设备投资大、耗能多；而后者投资少、耗能低，且操作简单、清洗方便、维修及更换成本低，产品收率高。渗透膜超滤浓缩方法中，絮凝工艺是提取工艺中最关键的一步，直接决定板框过滤等工序的工作与产品的质量。渗透膜超滤浓缩法流程如图6－14所示。

图6－14　渗透膜超滤浓缩制备液体糖化酶工艺流程

根据上述过程可知，糖化酶的分离提取主要有以下几个步骤。

1．酶液的获得与预处理

固态培养：取孢子布满麸曲、酶活力已达高峰的固态基质，用0．9%的生理盐水搅拌浸泡1h，4层纱布过滤，滤液于4℃，6000r／min，离心10min，上清液即为粗酶液。

液态培养：直接取发酵液于4℃下离心、洗涤，上清液经纱布过滤，合并后得到粗酶液。

预处理：由于发酵所采用的培养基大多含有麸皮等纤维成分，经初步分离所得的粗酶液中大多含有大量不溶性杂质，因此还需要经过絮凝和压滤的处理，从而大大改善发酵液的过滤性，提高澄清度。应用作为糖化酶絮凝剂的种类主要有APAM（阴离子聚丙烯酰胺）、苯甲酸钠、硅藻土、硫酸锌、黄血盐等，具体加入种类和浓度须经实验确定。精制浓缩液体糖化酶的生产过程中，絮凝工艺是最关键的一步。如果絮凝效果不好，将导致处理时间长，增加染菌的可能性。

2．酶液的浓缩

经过预处理的粗酶液一般糖化酶的浓度较低，不适合工业化需要，需要进一步地浓缩。其方法可采用真空浓缩、酒精沉淀、超滤等。前两种方法多用于固体酶制剂的制备，超滤多用于液体制剂的制备。

超滤是加压膜过滤方法的一种，其工作原理是在一定压力下把大溶质分子阻留在膜的一侧（留在原来的溶液中），而小溶质分子透过至膜的另一侧，从而达到分离纯化、浓缩产物的目的。超滤法适用于生物大分子发酵产品（如糖化酶、α－淀粉酶）等的提取纯化和浓缩。该工艺具有成本低、操作方便、条件温和、较好地保持酶活力、产品回收率高等优点。

该方法的使用过程中，需要根据产品质量和工艺要求选择超滤膜、进料口压力、出料口压力、进出料口之压差、操作温度（不超过40℃）、浓缩倍数等条件，以达到最佳的效果。运行过程中定时测定超滤液的流量及酶活力，以确认超滤器运行是否正常。

同时，李静等（2010）用双水相体系［PEG／KH₂PO₄、PEG／（NH₄）₂SO₄和PEG／MgSO₄］萃取糖化酶，其中以PEG／（NH4）₂SO₄双水相体系在PEG相对分子质量为20000、PEG溶液浓度为28%、（NH₄）₂SO₄溶液浓度为20%时，分配系数为0．15，萃取效果最好，即糖化酶回收率最高（96．1%）。

3．酶液的干燥与后处理

如果制作固体酶制剂，将获得的浓缩液沉淀、离心后，所得酶泥放入干燥箱中40℃热风干燥，干燥物磨粉后加入防腐剂、稳定剂（如苯甲酸钠、山梨醇、醋酸钙等）即得到粗酶制剂成品。

而液体酶制剂，只需在浓缩液中加入防腐剂、稳定剂即可。

二、糖化酶的性质分析

1．糖化酶活力测定

具体参考本书相关内容。

2．糖化酶性质

糖化酶相对分子质量：糖化酶是一种组合酶，采用离子交换层析法分离纯化其各种成分（测定有活性的），收集后，经电泳得到其相对分子质量。

最适反应温度：将适量经层析纯化的酶制剂溶于一定pH的缓冲液中，在不同温度下分别测定糖化酶活力，以最高酶活力为100%，绘出反应温度与酶活力的相关曲线。

热稳定性：将适量经层析纯化的酶制剂溶于一定pH的缓冲液中，在不同温度下分别保温不同时间后，测定糖化酶活力，以不经保温的酶活力为100%，绘出保温时间与酶活力的相关曲线。

最适pH：将适量经层析纯化的酶制剂溶于不同pH的缓冲液中，在最适温度下分别测定糖化酶活力，以最高酶活力为100%，绘出不同pH与酶活力的相关曲线。