糖化酶产生菌的分离筛选与选育

任务1　糖化酶产生菌的分离筛选与选育

糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。

一、菌种筛选与选育的方法与原理

1．菌种筛选诱变的总体步骤

菌种筛选诱变的总体步骤如图6－10所示。

2．基本原理

平板透明圈法是将牛津杯放置在已经凝固的淀粉琼脂平板上，每个平板放3～4个牛津杯（根据酶活力大小），然后将粗酶液定量加入牛津杯中，粗酶液就会通过扩散分解牛津杯周围的生淀粉，经过一段时间，淀粉琼脂平板上的牛津杯周围就会有透明的淀粉水解圈，酶活力越大的则水解圈也越大，根据水解圈的大小就可以确定酶活力大小。再通过摇床实验使粗酶液水解生淀粉，用DNS（3，5－二硝基水杨酸）法测定其水解产物中还原糖的量，从而确定粗酶液中糖化酶的酶活力。

图6－10　菌种筛选诱变的总体步骤

二、糖化酶产生菌的筛选与鉴定

1．初筛

称取一定量样品（淀粉厂附近的土壤、含淀粉霉变物、醋曲），加入装有一定量增殖培养基（以可溶性淀粉为唯一碳源）的三角瓶中，恒温30℃、200r／min培养3～5d。

取增殖培养后的上清液1mL于9mL灭菌生理盐水试管中，以此类推，制成10倍浓度梯度的稀释液，吸取各种稀释度溶液0．1mL涂布于选择性培养基平板上（以生淀粉为唯一碳源），置于30℃恒温培养箱中培养3d。观察选择性平板培养基上长出的菌落周围有无透明水解圈，取透明圈直径与菌落直径比值（D／d）较大者于筛选平板上划线分离至纯种，斜面保存。

2．复筛

从原种斜面取出菌体或孢子，接入装有一定量摇瓶筛选培养基的三角瓶中，每株平行3瓶并编号。在恒温30℃、200r／min条件下培养3d。取发酵液测定酶活力，记录并比较。将复筛后具有较高生淀粉酶活力的菌株进一步分离纯化，斜面保存。

3．鉴定

根据菌落特征、生理生化反应特征以及16SrRNA或18SrRNA的特性进行分类。由于产糖化酶的菌种种类较多，因此可分别参考相应的鉴定手册进行菌种鉴定。

三、糖化酶产生菌的选育

1．紫外诱变法

取一定量已育好的菌／孢子悬浮液（10⁵～10⁶CFU／mL）至培养皿中，在磁力搅拌器的搅拌下置于15W紫外线灭菌灯下30cm处分别处理0．5min、1．0min、2．0min、3．0 min、4．0min、5．0min、6．0min、7．0min、8．0min、9．0min、10．0min、11．0min、12．0 min、13．0min、14．0min、15．0min等不同时间段，然后吸取0．1mL处理液稀释到一定稀释度进行分离培养（筛选培养基），挑取其中D／d值大且生长快速的1个或几个诱变菌株，在摇瓶培养基中30℃培养3d，测其酶活力。

对于遗传性状的同种或不同种微生物对紫外线的敏感程度不同，因此在诱变之前要了解实验菌株对紫外线的敏感程度，即作出剂量（时间）对于致死率的曲线，由此选择合适的处理剂量。

2．化学诱变

可采用亚硝基胍诱变或2%硫酸二乙酯。方法是将一定量化学诱变剂与一定量的菌／孢子悬浮液混合，分别作用不同的时间段，然后取0．1mL各个时间段的溶液滴入筛选平板涂布均匀，培养，挑取其中D／d值大且生长快速的1个或几个诱变菌株，在摇瓶培养基中30℃培养3d，测其酶活力。

化学诱变剂的剂量主要取决于其浓度和处理时间。在进行化学诱变处理时，控制使用剂量要以诱变效应大而副反应小为原则。