ε-聚赖氨酸高产菌的筛选

ε-聚赖氨酸高产菌的筛选

曹伟锋　赵　颖　袁国栋　谭之磊　贾士儒⁽¹⁾

（天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：依据传统诱变理论和白色链霉菌生物合成ε-聚赖氨酸的特点，确立了以面包酵母菌为敏感菌，抑菌圈为基准的筛选方法。在优化诱变条件的基础上，以白色链霉菌UV38为出发菌株，经紫外线与硫酸二乙酯复合诱、N⁺离子注入诱变选育出一株遗传性状稳定酸菌株DUL10，比出发菌株抑菌性能提高33.5%。

关键词： ε-聚赖氨酸；白色链霉菌；诱变育种

有机食品是世界食品工业发展的趋势，食品防腐剂的天然化成为这一趋势的必然要求。目前ε-聚赖氨酸是最具优良性能和巨大商业价值的生物防腐剂之一^[1]。它是含有25～30个赖氨酸残基的阳离子聚合多肽，当聚合度低于10肽，会丧失抑菌活性^[2]。 ε-聚赖氨酸抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有抑制作用，而且对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用^[3]。同时，其热稳定性高，水溶性好，食用安全，因此，广泛用于食品保鲜^[4]。此外，在基因治疗^[5]、微囊药物的制备^[6]、高分子材料等领域中，ε-聚赖氨酸亦有着广泛的用途。文中以筛选获得的白色链霉菌UV38为出发菌株，通过紫外线与硫酸二乙酯复合诱变，N⁺离子注入诱变处理，对ε-聚赖氨酸高产菌株进行了筛选。

1　材料和方法

1.1　出发菌株

白色链霉菌（Streptomyces albulus） UV38天津科技大学生化工程研究室保藏。

（页下注）通讯作者：贾士儒Tel： 022-60601606　　E： mail： jiashiru@tust.edu.cn

1.2　培养基

1.2.1　贝纳特斜面培养基（%）^[7]

1.2.2　YEPD培养基（%）^[10]

1.3　试剂

2%硫代硫酸钠溶液，pH7.0磷酸缓冲溶液。

1.4　诱变育种

1.4.1　硫酸二乙酯（DES）诱变^[10]

1.4.2　紫外线（UV）诱变^[10]

1.4.3　DES+ UV复合诱变^[10]

1.4.4　N⁺离子注入诱变^[12]

1.4.4.1　N⁺离子注入前样品的处理^[13]

1.4.4.2　离子注入

采用N+离子，能量30KeV，剂量1.0×10¹⁴，5.0×10¹⁴，8.0×10¹⁴，1.0×10¹⁵，3.0×10¹⁵，5.0×10¹⁵，8.0×10¹⁵，1.0×10¹⁶N⁺/cm²。

1.4.4.3　离子注入处理

离子注入机是由郑州大学提供，在注入机上，用不同的剂量对白色链霉菌的孢子进行注入;注入靶室的真空密度为5×10^-2Pa。

1.5　筛选方法

1.5.1　初筛方法

采用管碟法测定100μl发酵液的抑菌圈直径^[7]。

1.5.2　复筛方法将初筛得到的菌株转接于摇瓶发酵培养适当时间，采用管碟法测定100μl发酵液的抑菌圈直径。

1.5.3　筛选标准的建立规定对离子注入后的菌株进行筛选时，突变株抑菌圈直径大于对照5%的突变株称为正突变，而小于5%的菌株称为负突变，在±5%之间作为未突变。

1.6　分析方法

见参考文献14。

2　结果与讨论

2.1　敏感菌的确定

根据白色链霉菌代谢产物ε-聚赖氨酸的抑菌特性，采用管碟法，测定100μl发酵液的抑菌性能，选用酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉、枯草芽孢杆菌、米根霉做敏感性对比试验，结果表明（见表1） ，金黄色葡萄球菌为敏感菌时其抑菌圈最大为28.2mm，但其为致病菌，而酵母菌为非致病性菌，且在食品业广泛应用，以其为供试菌株时所形成的抑菌圈也较为清晰可辨，如图1，所以实验中选择酵母菌为敏感菌。

表1　敏感菌的确定

2.2　白色链霉菌诱变筛选

2.2.1　紫外线（UV）诱变处理

通过UV照射30 S、60 S、90 S、120 S的孢子悬浮液，孢子存活率分别为63.6%、7.5%、3.7%和0.0% （见图2） ，根据遗传育种的经验，正向突变较多地出现在偏低剂量中，因此依照白色链霉菌存活率曲线图，确定45 S为最适剂量。

图2　Streptomyces albulus紫外线诱变存活率

2.2.2　硫酸二乙酯处理时间和用量确定

图3和图4表明，以UV38为出发菌株，当用诱变处理时间为25min，细胞的存活率为4.08%；突变率最大为60.98%。当DES体积浓度为1.0%时，菌体存活率为17.6%，突变率为45.27%。说明存活率较低时，正向突变率较大。同时也可以看出，随着诱变剂量的增加，突变率反而下降。上述现象说明DES对白色￥链霉菌的诱变有最适剂量。因此确定DES的最适剂量为：诱变时间25min，DES浓度为1.0% （体积） 。

图3　DES最佳诱变时间的确定

Fig3 The determination of optimum

treating period with DES

存活率　突变率

图4　DES诱变最佳浓度的确定

Fig4 The determination of optimum

treating concentration with DES

存活率　突变率

2.2.3　复合诱变方法的确立

2.2.1和2.2.2单从硫酸二乙酯和紫外线单独作用的角度得出的结论，但其二者复合作用将对细胞致死率和突变率造成一定的影响，另外还存在着硫酸二乙酯和紫外线处理次序的问题，因此主要运用DES+UV复合诱变的方法筛选高产菌株。出发菌株UV38遗传性状稳定，DES通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。^[8]但烷化剂不能和胸腺嘧啶反应，腺嘌呤的烷化作用也较少发生（仅占烷化反应的5%～10%）^[9]。

紫外线（UV）的诱变频率高，而且不易回复突变^[8]，主要导致形成嘧啶二聚体^[9]，因此选择的复合诱变方案为先DES后UV处理。

吸取单孢子悬液4 ml，加入16ml pH7.0磷酸缓冲液，混匀后加入0.2 ml DES （1%） ，30℃恒温振荡一定时间，加入10ml 25% Na₂S₂O₃终止反应。然后吸取DES诱变后的悬液10 ml于φ9 cm无菌平皿中，打开皿盖，在磁力搅拌状态下用紫外灯（波长253.6nm，功率15w，照射距离30cm）照射一定时间。组合为： a、紫外45s + DES 15min； b、紫外20s + DES 25min； c、紫外20s + DES 25min。

2.2.4　注入离子的选择

目前，用于微生物离子注入诱变的离子主要为H⁺，Ar⁺，N+，三者在其他条件不变的情况下，在致死率关系上还存在着一些争议，但普遍认为N⁺的诱变效率最高，因为N⁺为组成DNA碱基的重要元素之一，N⁺注入不仅可以直接引起前碱基分子结构的变化，还可以参与细胞的重组和修复，产生的诱变突变较多，因此常用于微生物和植物诱变育种^[11]，所以这里选择N⁺对DES+UV诱变所得菌株进行处理。

2.2.5　诱变筛选结果

2.3.5.1　DES+UV复合诱变的结果

经初筛与复筛后获得5株菌的抑菌圈直径比UV38大的比较明显，如表2所示。其中DU82遗传性状稳定，菌株的电镜图如图5所示，菌丝比较粗壮，孢子椭圆形。DU82与UV38的抑菌圈见图6。

表2　DES+UV复合诱变突变株的筛选结果

图5　DU82的电镜照片

图6　DU82 （右）与UV38 （左）的抑菌圈图片

由表2可看出DES+UV诱变后正向突变菌株的抑菌圈直径最大为17.7mm。为进一步提高菌株的产量，选择DU82为N⁺离子注入诱变的出发菌株。

2.3.5.2　N⁺离子注入诱变结果

2.3.5.2.1　用30keV能量不同剂量注入白色链霉菌孢子对它存活率和突变率进行了考察。存活率曲线见图7。

图7　在30keV能量下不同剂量下的存活率

由图7可以看出白色链霉菌在30keV能量下的存活率在陡降后又有一回升，之后形成两个峰。陡降的原因可能为无菌平皿放入注入靶室并密封后，立即抽真空，进行离子注入时间仅10秒左右，之后又将靶室升压与大气压相等取出平皿，此过程经历压力变化较为剧烈，应为细胞致死的主要原因。之后的存活率上升应为压力变化的幅度影响减少，离子注入剂量起主导作用，随剂量的增加，致死率上升。在8×10¹⁵ion/cm²致死率的减少可能为细胞在此时产生了应激反应，具体原因还不大清楚，但如不计初始的陡降点，在该位点的变化与其他文献^[13]所述马鞍型曲线相似。

2.3.5.2.2　经初筛与复筛后获得5株菌的抑菌圈直径比DU82大的比较明显，如表3所示。其中DUL10经数代继传均遗传性状稳定，比出发菌株UV38抑菌性能提高了33.5%。菌株的电镜图如图8所示，菌丝较DU82较细，孢子椭圆形。DU82与DUL10的抑菌圈见图9。

图8　DUL10电镜照片

图9　DU82 （1）DUL80 （2） DUL32 （3）与DUL10 （4）的抑菌圈图片

表3　N⁺离子注入诱变突变株的筛选结果

参考文献：

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[4]徐红华，王英东，赵新淮.多聚赖氨酸在食品抑菌方面的研究进展[J].粮油食品科技，1999，7： 33～34

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[8]施巧琴，吴松刚主编.工业微生物育种学.第2版.北京：科学出版社，2003

[9]章名春编著.工业微生物诱变育种.北京：科学出版社出版，1984

[10]杜连祥，等编著.天津：天津科学技术出版社，1992

[11]李市场，白爱枝.低能离子注入木聚糖酶产生菌黑曲霉（Aspergillus Nigerr）育种中参数的优化.激光生物学报，2003，12 （5）

[12]徐增亮著.离子束生物技术引论.安徽科学技术出版社出版，1998

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[14]姜俊云，贾士儒，等.搅拌转速和pH对ε-聚赖氨酸发酵的影响.生物加工过程，2004，2 （2）

【注释】

(1)基金项目：国家“十五”科技攻关项目（编号： 2004BA713B05-06）