糖化酶的固态发酵生产

技能训练1　糖化酶的固态发酵生产

一、能力目标

①根据所学知识，能描述糖化酶的固态发酵生产的大致流程。

②参照相关材料，能完成糖化酶的固态发酵生产过程。

③学会糖化酶酶活力的测定方法。

二、生产工艺流程

糖化酶固态发酵工艺流程如图6－15所示。

图6－15　糖化酶固态发酵工艺流程

三、实训材料

1．菌种

黑曲霉变异株：经紫外线和硫酸二乙酯复合诱变而成。

2．培养基

孢子培养基：察氏培养基。

产酶培养基（g／g）：麦麸、豆饼粉的比例为3∶1，（NH₄）₂SO₄3%，K₂HPO₄0．1%，含水量为120%，粉碎度为过60目筛，pH为5。

3．实验仪器与设备

电子天平、pH计、数显式电热恒温水浴锅、立式蒸汽压力灭菌器、霉菌培养箱、电热鼓风干燥器、净化工作台。

四、操作要点

1．孢子悬浮液的制备

将保存于冷藏柜中的菌株取出，用孢子培养基连续活化2次。再将长满成熟孢子的斜面培养基用无菌生理盐水洗涤，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，再在200r／min的摇床中充分振荡30min，用灭菌后的脱脂棉滤去菌丝片段，制得单孢子悬浮液。用血球计数板计数，将孢子数调整为10⁸个／mL。

2．摇瓶发酵

在500mL的三角瓶中加入配好的产酶培养基，121℃、1．01×10⁵Pa灭菌30min。冷却后接入2．5mL孢子悬浮液，温度为32℃，在霉菌培养箱中培养4～6d（120h左右）。

五、成品活性检验

（一）实验原理

糖化型淀粉酶（即淀粉α－1，4－葡萄糖苷酶）有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α－1，4－糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。

（二）实验试剂

1．0．1mol／L pH4．6醋酸钠缓冲液

称取醋酸钠（CH3COONa·3H2O）6．7g和冰醋酸（CH3COOH）2．6mL，用蒸馏水溶解，定容至1000mL。上述缓冲液应以酸度计或精密试纸校正pH。

2．0．1mol／L硫代硫酸钠溶液

（1）配制

称取硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃·5H₂O）24．82g和硫酸钠0．2g溶于煮沸后冷却的蒸馏水中，定容至1000mL，即得0．1mol／L硫代硫酸钠溶液。储存于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期，标定使用。0．05mol／L溶液则用蒸馏水稀释制得。

（2）标定

取在120℃下干燥至恒重的标准重铬酸钾0．25g，精密称量。置于碘量瓶中，加水50mL使溶解，加碘化钾2g。轻轻振摇使溶解，加1mol／L硫酸溶液40mL摇匀，密塞。在暗处放置10min后用蒸馏水250mL稀释，用此液滴定至近终点时，加淀粉指示液3mL，继续滴定至蓝色消失而显亮绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。1mL的0．1 mol／L硫代硫酸钠液相当于4．903mg重铬酸钾。根据本液的消耗量与重铬酸钾的用量，计算硫代硫酸钠的浓度。本溶液需每月标定一次。

3．0．1mol／L碘液

称取碘化钾（KI）36g，溶解在100mL蒸馏水中，再加入碘（I₂）12．98g溶解，定容至1000mL储存于棕色瓶中。

用标准的0．05mol／L硫代硫酸钠溶液标定碘液。

吸取10mL待标定的碘液放入250mL碘量瓶中，以0．05mol／L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时，加入1%淀粉指示剂1～2滴，继续滴定至无色为终点。

式中：c为碘的物质的量浓度；c₁为硫代硫酸钠的物质的量浓度，mol／L；V1为消耗硫代硫酸钠的体积，mL；V为碘液的体积，mL。

4．0．1mol／L氢氧化钠溶液

称取4g氢氧化钠（NaOH）加蒸馏水溶解，定容至1000mL。

5．1mol／L硫酸溶液

量取浓硫酸5．6mL，慢慢加入80mL蒸馏水中，冷却后定容至100mL，摇匀。

6．20%氢氧化钠溶液

称取20g氢氧化钠，溶解定容至100mL。

7．2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉2g，然后用少量蒸馏水调匀，缓慢倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至100mL。此溶液需当天配制。

（三）实验方法

1．待测酶液的制备

发酵结束以后，在三角瓶中直接加入适量pH4．6醋酸钠缓冲液，40℃水浴振荡浸提1h后，用4层纱布过滤得粗酶液（用前可用pH4．6醋酸钠缓冲液适当稀释），供测定用。

2．测定

于甲、乙两支比色管中（50mL），分别加入20%可溶性淀粉溶液25mL及0．1mol／L pH4．6的醋酸－醋酸钠缓冲液5mL，摇匀，40℃的恒温水浴中预热（5～10min）。在甲管中加入酶液2mL（酶活力总量为100～170单位），立即记时间，摇匀。在此温度下准确反应1h后，立即各加20%NaOH溶液0．2mL，摇匀，将两管取出迅速用水冷却，并于乙管中补加酶液2mL。

取上述反应液5mL放入碘量瓶中，准确加入0．1mol／L碘液10mL，再加入0．1 mol／L氢氧化钠15mL，同时摇晃。暗处放置15min，加入1mol／L硫酸2mL，用0．05 mol／L硫代硫酸钠溶液滴定至无色为终点。

（四）实验结果

糖化酶活力单位的定义：在40℃、pH4．6的条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。

式中：A为空白所消耗硫代硫酸钠的体积，mL；5为样品所消耗硫代硫酸钠的体积，mL；c为硫代硫酸钠的物质的量浓度；90．05为与1mL 1mol／L硫代硫酸钠相当的葡萄糖的质量，mg；1／2为折算成1mL酶液的量；32．2为反应液总体积，mL；n为稀释倍数。

（五）注意事项

①酶液制备时，酶液浓度最好控制在消耗0．05mol／L硫代硫酸钠（空白和样品）的差值为3～6mL（以每毫升50～90单位为宜）。

②为统—起见，可溶性淀粉使用浙江菱湖淀粉厂生产的化学纯试剂配制，如暂不能购买，而需使用其他厂生产的可溶性淀粉时，必须做对照试验。

六、实训报告

写出书面实训报告，并着重分析过程中出现的问题以及解决的办法。

七、实训思考题

1．试着设计糖化酶发酵罐固态发酵生产的大致方案，并分析摇瓶发酵和发酵罐发酵之间的区别。

2．总结整个实验过程中的注意事项。