糖化酶的液态发酵生产

技能训练2　糖化酶的液态发酵生产

一、能力目标

①借助相关材料，能完成糖化酶制剂的液态发酵过程的操作。

②理解酶制剂超滤浓缩的原理，并能独立完成其操作步骤。

③理解无机盐沉淀和有机溶剂沉淀法提取酶的原理，能独立操作其过程。

二、生产工艺流程

糖化酶的液态发酵生产工艺流程如图6－16所示。

图6－16　糖化酶的液态发酵生产工艺流程

三、实训材料

1．菌种

黑曲霉UV－11。

2．培养基

（1）斜面培养基

土豆培养基。

（2）麸皮种子培养基

小麦麸皮与水的比例为1∶（1．1～1．3），接种后于30～32℃培养4～5d至长满丰富的孢子，中间翻曲。

（3）发酵培养基

玉米粉13．5%，豆饼粉3．5%，麸皮1．0%，玉米浆2．0%，无机盐。

3．实验仪器与设备

灭菌锅、试管、棉塞、培养基原料、培养箱、500mL三角瓶。

25L全自动发酵罐、恒温培养箱、板框压滤机、膜过滤装置。

四、操作要点

1．种子制备

固体孢子培养：将10g麸皮和10mL水拌匀后灭菌30min，冷却后接入一环斜面菌种，于30～32℃培养4～5d至长满丰富的孢子备用。

种子罐培养：玉米粉6%，黄豆饼粉2%，麸皮2%。在31℃下通风培养32h，通气比为0．5∶1。当pH下降到3．8，酶活力在500U／mL左右，镜检菌丝生长正常且无杂菌污染时，即可接入二级种子罐或发酵罐。

2．25L罐发酵

按配方配制培养基（装液量15L），调pH至4．0，加入发酵罐中，121℃灭菌30min，冷却，待温度降至30～32℃，接入一个三角瓶的孢子悬液或种子罐培养的种子，在30℃、罐压0．05MPa下搅拌培养，搅拌速度为500r／min。通气比：0～12h为0．5∶1；12～24 h为0．8∶1；24～84h为1．0∶1；84h后为0．8∶1。

3．发酵过程监控

每隔12h取样测定酶活力、pH、还原糖及总糖浓度并作镜检。当pH降至3．4，还原糖降至1．8%以下，酶活力上升至13600U／mL以上时，即可放罐。

4．发酵液过滤

洗净板框压滤机，装好滤布，接好板框压滤机的管道，泵料过滤，加水洗涤，空气吹干，过滤结束后洗净过滤机及有关设备。量取滤液体积，取样测定糖化酶活力。

5．超滤浓缩

量取10L糖化酶的滤液加入到超滤装置的储罐中，开动循环料液泵进行超滤，控制超滤压力小于0．4MPa。每隔20min用量筒测量透过液流量，比较透过液流量的变化。当浓缩倍数达到3～5倍时，停止超滤。

测量浓缩液体积，原酶液、浓缩液和透过液的酶活力。

6．有机溶剂沉淀

取1L浓缩液，用盐酸调节pH至3．5。在10～20℃条件下加入3．5倍冷冻的无水酒精，边加边搅拌，即可发现酶的沉淀现象。沉淀物用布氏漏斗抽滤。称量酶泥的质量，测定酶活力。

7．无机盐沉淀

取1L浓缩液，按55g／（100mL）加硫酸铵，静止盐析1h。沉淀物用布氏漏斗抽滤。称量酶泥的质量，测定酶活力。

8．酶泥的干燥

将上述步骤中得到的酶泥放入干燥箱中，在40℃下以热风干燥，将干燥的制品磨粉即得成品。将成品称量并测定酶活力。

五、过程检验及成品酶活力测定

1．黑曲霉镜检

（1）染料

草酸铵结晶紫液（A液：1%结晶紫加95%酒精溶液；B液：1%草酸铵溶液。取A液20mL，B液80mL混合，静置48h后使用）。

（2）镜检过程

涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。

2．总糖的测定

斐林法测定发酵液中的总糖。

3．还原糖的测定

DNS法，参考本书相关内容。

4．糖化酶酶活力的测定

参考本书相关内容。

5．pH、溶解氧的跟踪测定

从二次仪表直接读取。

六、实训报告

写出书面实训报告，并着重分析过程中出现的问题以及解决的办法。

七、实训思考题

1．还原糖的测定除了DNS法还有什么方法？

2．糖化酶固态发酵与液态发酵的异同有哪些？