氮离子注入选育耐酸性α-淀粉酶生产菌株

氮离子注入选育耐酸性α-淀粉酶生产菌株

王海燕　戚　薇　王建玲　杜连祥

（天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室　天津　300222）

摘要：利用低能氮离子注入对中性α-淀粉酶生产菌BF7658进行诱变。结果表明，30keV能量的氮离子注入后，“马鞍区”对应注入剂量（50×10¹⁴～100×10¹⁴ions／cm²）下所引起的突变率最高。通过诱变筛选到一株最适作用pH值为5.0，较出发菌株偏低一个pH值单位的突变株TUST743。该突变株产酸性α-淀粉酶的摇瓶发酵单位达到343u/ml。该酶在pH4.5和4.0条件下的相对酶活分别为61%和38%，说明此菌株的α-淀粉酶对低pH有很好的耐受性。经连续传代实验，表明该菌株遗传性质稳定。

关键词：氮离子注入；诱变育种；耐酸性α-淀粉酶

近年来，随着淀粉质原料深加工工业的发展和工艺条件的改变，要求酶制剂工业不断更新和完善淀粉酶的种类以满足工业生产的需求。目前，国内外市场上常用的两类中温和高温α-淀粉酶，其最适作用pH值范围均在6～7，在酸性条件下酶活明显降低，故不能满足酸性条件下淀粉质原料深加工工艺的要求。而耐酸性α-淀粉酶的最适作用pH范围在2.0～5.5，其酸稳定性明显高于中性α-淀粉酶，故可广泛应用于青贮饲料、发酵饮料、药物的生产以及工业副产品的加工、废料的处理等多种领域^[1，2]。

目前，我国中温中性α-淀粉酶生产所用的菌株为解淀粉芽孢杆菌（BaciLLus amy Liquefaciens） BF7658。该菌是经过紫外线、NTG等常规的物理化学手段多次诱变而得到的高产菌株。由于菌种对同一种长期接触的诱变剂存在饱和效应，因此，本实验采用一种新型的诱变技术，即低能氮离子注入的方法对BF7658进行诱变，以筛选产酸性中温α-淀粉酶的菌株。

1　材料与方法

1.1　出发菌株

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyliquefaciens） BF7658。

1.2　培养基

1.2.1　斜面培养基（%，w/v）

土豆20，硫酸镁0.5，琼脂1.6～2.0，pH自然。

1.2.2　种子培养基（%，w/v）

可溶性淀粉2，NaCl 0.5，蛋白胨1，pH6.0 （出发菌株）或pH5.0 （突变株） 。

1.2.3　发酵培养基（%，w/v）

玉米粉9，豆饼粉5，磷酸氢二钠0.8，硫酸铵0.4，无水氯化钙0.2，pH6.0 （出发菌株）或pH5.0 （突变株） 。

1.2.4　平板筛选培养基（%，w/v）

可溶性淀粉2，蛋白胨1，氯化钠0.5，琼脂1.6～2.0，pH4.0～5.0。

1.3　仪器

离子束注入装置由郑州大学提供，能量： 30Kev，脉冲： 25Hz，真空度5～6×10^-3KPa；

1.4　培养方法

取一环斜面培养物接入装有25ml种子培养基的250ml三角瓶中，37℃，160r/min振荡培养约14h，然后以1%～3%接种量接入装有40ml发酵培养基的500ml三角瓶中，37℃，160r/min振荡培养32～36h。

1.5　N⁺注入诱变

每个无菌平板加入0.1ml稀释好的孢子悬液（约含10⁸～10⁹ml^-1） ，涂布均匀，无菌风吹干（每一注入剂量做一个真空对照） ，用30keV的氮离子（N⁺）注入处理，剂量分别为5×10¹⁴ions/cm²、10 ×10¹⁴ions/cm²、20 ×10¹⁴ions/cm²、30 ×10¹⁴ions/cm²、50 ×10¹⁴ions/cm²、80 ×10¹⁴ions/cm²、100×10¹⁴ions/cm²、200×10¹⁴ions/cm²。注入后用无菌水洗下菌体，适当稀释。将诱变孢子稀释液涂布在pH6.0淀粉平板上（以每皿生长出30～100左右的菌落为宜） ，37℃培养36～48h。

存活率（%） =注入后不含链霉素平板上长出的菌落数/真空对照平板上长出的菌落数×100%

1.6　α-淀粉酶活力的测定

根据QB/T1803-93测定方法^[5]，酶活定义： 1g固体酶粉（或1ml液体酶） ，于60℃、pH6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u／g （或u／ml）表示。耐酸性α-淀粉酶的酶活在相应的酸性pH值下测定。

1.7　筛选方法

1.7.1　初筛

将N⁺注入处理后长出的菌株，点接的筛选平板上，培养48h后挑选周围有透明圈的菌株进行摇瓶复筛。

1.7.2　复筛

对初筛后挑出的产酸性α-淀粉酶的突变株进行摇瓶发酵，测定所得到的粗酶在不同pH值下的酶活。

1.8　粗酶的制备

将发酵液8000r/min离心10min，取上清液用硫酸胺分级盐析，取饱和度40%～70%分级盐析得到的沉淀，溶于去离子水中，透析袋透析除盐即得粗酶。

2　结果与讨论

2.1　注入剂量与存活曲线

实验以能量30keV的氮离子，在5×10¹⁴ions／cm²～ 200×10¹⁴ions/cm²剂量范围内，采用不同的剂量对解淀粉芽孢杆菌BF7658进行离子注入，测定不同剂量下的菌体存活率，如图1所示。

图1　不同剂量下的存活率

从图1可以得知，随氮离子注入剂量的增加，菌株存活率曲线呈现较明显的先降后生再降的“马鞍型”变化，即小剂量注入时存活率较高，随剂量增加存活率下降，当注入剂量增至50×10¹⁴ions/cm²时，存活率降为16%，但剂量继续增加至100×10¹⁴ions/cm²时，存活率回升到22%，然后又逐渐下降，注入剂量为200×10¹⁴ions/cm²时的存活率为9%。此存活曲线与紫外线或γ射线辐照下的“直线型”存活率曲线不同，说明离子注入与其他电离辐射的作用机制存在很大差异。

据研究报道，这种特有的“马鞍型”变化是能量、动量作用下的损伤效应和质量、电荷作用下的保护和刺激综合作用的结果：当N⁺注入剂量较小时，造成存活率下降的主要原因是能量沉积效应和动量传递效应合作用和结果，低能量N⁺直接或通过产生的大量自由基导致DNA和生物膜等其他生物分子的损伤，从而造成存活率下降；而在中高剂量下，由于连续注入电荷的堆积产生很强的库仑力，从而对被注入细胞形成一个“保护屏障” ，阻碍后续注入离子对细胞损伤，从而达到对细胞的保护作用，而且大量堆积的电荷可形成一个弱电场，这种电场的刺激效应可激活细胞内的各种修复酶，从而提高了损伤修复的效率，并且在中离子剂量下所产生的质量沉积效应也可生成新的产物，这些产物能与细胞内的DNA和蛋白质等生物大分子竞争自由基，从而减轻自由基对细胞的损伤作用，使存活率反而上升；而在高剂量下，能量沉积和动量传递所造成的DNA和生物膜等其他生物大分子的严重损伤已超出了其所具有的修复能力，且大量堆积的电荷达到一定的临界值后会产生库仑爆炸，其形成的“保护屏障”作用也就不复存在，因此存活率又迅速降低^[6，7]。

2.2　注入剂量与突变率的关系

出发菌株BF7658所产α-淀粉酶的最适作用pH值为6.0，pH值降低，该酶的活力下降。实验挑取经不同注入剂量诱变的菌株各100个，进行摇瓶发酵，测定粗酶液在不同pH值下的酶活。规定：酶的最适作用pH值比出发菌株偏低一个pH值单位以上，为正突变；偏高一个pH值单位以上，为负突变；接近则为未突变，结果见图2。

图2　不同剂量下的突变率

从图2可以看出，当注入剂量为50×10¹⁴ions／cm²～100×10¹⁴ions／cm²时，正突变率（16.7%～23.1%）较高，同时负突变率（12.8%～20.4%）也较高，而该剂量范围恰好对应在“马鞍区” 。该结果与文献所报道的在“马鞍”区域菌株最易发生突变相一致^[8]。

2.3　耐酸性α-淀粉酶产生菌选育及粗酶特性

实验从近900株菌中，筛选到一株高产耐酸性α-淀粉酶的突变株，编号为TUST743 （N⁺注入剂量为100×10¹⁴N⁺/cm²下得到） （见图3） 。该突变株生产耐酸性α-淀粉酶的摇瓶发酵单位达到343u/ml，较出发菌株BF7658产α-淀粉酶的摇瓶发酵单位（313u/ml）高9.6%。

图3　BF7658与TUST743的α-淀粉酶在不同pH下的相对酶活

从图3可以看出，突变株TUST743所产α-淀粉酶的最适作用pH值为5.0，较出发菌株BF7658的最适作用pH值偏低一个单位。且该突变株所产的α-淀粉酶在pH4.5和4.0条件下的相对酶活分别为61%和38%；而出发菌株的α-淀粉酶在pH5.0、4.5和4.0条件下的相对酶活分别为86%、37%和20%，说明突变株TUST743产的α-淀粉酶具有较强的耐酸性。

2.4　突变株遗传稳定性考察

将TUST743在固体斜面培养基上连续传代4次，将不同传代次数的菌株在最适条件下进行摇瓶种子培养和摇瓶发酵（每代作5个平行摇瓶） ，测定α-淀粉酶的发酵单位，结果见表1。

表1　突变株TUST743传代稳定性考察

注：上表数据为pH5.0条件下测得的酶活。

从表1中可以看出，TUST743各代α-淀粉酶的摇瓶发酵单位稳定在310～340u/ml，说明该菌株遗传稳定性较好。

3　结论

对于耐酸性α-淀粉酶为什么能在强酸性环境中保持其活性的问题，有研究者通过对酶蛋白的氨基酸分析，发现酸性α-淀粉酶的酸性和碱性氨基酸的含量比中性α-淀粉酶少30%。有研究表明，酶蛋白的耐酸性与其在低pH条件下的带电性有关^[9]。当pH低于等电点时，碱性氨基酸残基带有正电荷，大量正电荷相互排斥，导致蛋白质结构展开，从而影响催化中心的活性。如果酶蛋白中的酸性和碱性氨基酸的含量较低，则带电量较小，pH值的变化对酶活的影响不大。所以带电氨基酸的含量较低可能是耐酸性α-淀粉酶具有酸稳定特性的原因。此方面还待进行大量的研究。

参考文献：

[1]高崎义幸.日本开发耐热耐酸性α-淀粉酶.日本食品工业，1994，6 （30）:44～50

[2]张丽苹，徐岩，金建中.酸性α-淀粉酶的研究与应用[J].酿酒，2002，29 （3）:19

[3] Yu Zengliang.The role of radiation in the cringin and evolution of Life [M].Japan： Kyoto University Press. 2000.175

[4]杜连祥，等.工业微生物学实验技术.天津：天津科学技术出版社，1992.39

[5]QB／T1803-93，中国食品工业标准汇编（饮料酒） [s]

[6]陈宇，林梓鑫，张峰，等.离子注入微生物的生物效应研究[J].中国抗生素杂志，1998，23（6）:415～419

[7] Song Daojun，Yao Jianming，Shao Chunlin. A possible mechanism of dose related survival of microorganism implanted byN+ ions [J]. High TechnologyLetters ，1999 ，22（3）:129～32

[8]余增亮.离子束生物技术引论.合肥：安徽科学技术出版社，1998.241～246

[9]The determinants of alpha-amylasep Hactivityprofiles.Protein Eng.2001JuL，14 （7） :505～12