发状念珠藻耐碱性细胞株的分离筛选

6．7．1　发状念珠藻耐碱性细胞株的分离筛选

开放式培养技术简单、投资低廉、建造容易，生产过程的操作维修简便，在微藻培养中得到良好的发展并一直沿用至今，但由于不是在无菌状态下培养，培养过程容易污染其他微生物，难以进行目的培养物的纯培养。目前世界上成功地进行开放式商业化大规模培养的是一些能够在高盐、高碱环境下生长的藻种，如盐藻、螺旋藻等。欲实现发状念珠藻细胞的开放式培养，必须首先筛选出能耐受极端环境的发状念珠藻细胞株，根据发状念珠藻的生态学特性，筛选耐碱性发状念珠藻细胞株是实现发状念珠藻细胞开放式培养的基础。

6．7．1．1　碱性培养基中发状念珠藻细胞的生长

将发状念珠藻细胞接种在初始pH 10．0的碱性培养基中培养，培养过程中细胞培养液逐渐变黄，颜色加深。培养8～10天后，培养液基本呈现黄绿色，镜检可观察到大部分细胞解体死亡，但仍见部分绿色的细胞团，外面有较厚的黏液层包被。吸取该培养液1ml均匀涂布于pH 10．0的BG11固体平板上，培养10天，在平板表面有绿色的藻落形成。挑取平板上生长良好的藻落，接入pH 10．0的碱性BG11液体培养基中，经多次反复培养筛选，得到耐碱性发状念珠藻细胞株。在初始pH 10．0培养基中培养10天，耐碱性细胞株的培养液仍呈鲜绿色，而原始细胞株的培养液明显呈现出黄色，说明初始高pH值条件不利于原始发状念珠藻细胞株的生长，大部分营养细胞裂解死亡，培养液因细胞内水溶性色素的释放而变为黄色。而所筛选的耐碱性细胞株可在高碱性条件下正常生长。

碱性环境可以抑制发状念珠藻细胞培养过程中杂藻尤其是小球藻等绿藻的生长，选育出耐碱性发状念珠藻细胞株，可以在开放的培养条件下，通过控制培养基保持较高pH值来保持培养过程中发状念珠藻细胞的单种培养。

6．7．1．2　耐碱性细胞株形态及光合特性

在液体悬浮培养过程中发现耐碱性细胞株在培养液中悬浮性较差，易沉降。镜检可观察到耐碱性细胞株与发状念珠藻原始细胞株在形态结构上存在一定的差异。耐碱性发状念珠藻细胞均形成不规则的细胞团，藻丝高度折叠卷曲，其外有一层较厚的胶质鞘包裹；而原始细胞株基本呈念珠状，几乎观察不到胶质鞘的存在。胶质鞘的形成可能是发状念珠藻细胞能耐受高碱性环境的重要原因之一。发状念珠藻胶质主要是由细胞分泌产生的多糖物质组成，耐碱性细胞株细胞外胶质鞘结构中的酸性多糖可以中和培养基的碱性物质，使鞘内的细胞具有一个较为适宜的生长环境，可以维持正常的生长代谢，从而在高碱性的条件下生长。在高pH值下细胞培养物易发生沉降可能是因为当溶液的pH值较高时，藻细胞表面的一些多羟基的有机酸或糖类成分发生解离，使细胞表面带有一定的电荷（一般为负电荷）。当体系的pH值升高，细胞表面的净电荷将会发生变化甚至出现零电荷（可称为细胞的“等电点”），从而导致细胞自絮凝现象的发生，形成沉降。

耐碱性细胞株与原始细胞株分别接种于pH 10．0的BG11培养基中培养24小时，测定光合速率及呼吸速率的结果如图6－32所示。

pH 10．0时，耐碱性细胞株的光合速率高于原始发状念珠藻细胞。发状念珠藻作为专性光合自养生物，其生长依赖于光合作用提供能量并合成细胞生长所需的有机物质，因此较高的光合速率对细胞生长有利，可见耐碱性细胞株对碱性环境的适应性更强。

图6－32　耐碱性细胞株与原始细胞株在pH 10．0下光合速率及呼吸速率的比较