耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达

路福平　刘逸寒　杜连祥

（天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：本研究利用表达载体pET-30a，实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd在大肠杆菌BL21 （DE3）中的高效表达。利用SDS-PAGE分别对超声破碎后的上清和沉淀进行分析，amyd酶分子量为63.5kDa。重组酶amyd的最适温度80℃，最适反应pH为4.5，在温度不超过80℃，反应pH4.0到6.5之间，酶活较稳定。

关键词：耐酸性高温α-淀粉酶，基因克隆，表达，酶学性质

耐高温α-淀粉酶是食品工业中应用最普遍的酶种之一，广泛应用于啤酒、酒精、味精及淀粉工业等领域^[1]。其适用pH范围为6～7 ，在酸性条件下其酶活明显降低，因此不能适应我国酒精、淀粉糖等淀粉深加工行业工艺的要求。为了给淀粉原料的深加工提供更好的条件，开创新的酶法工艺，提高收得率、降低消耗、提高产品的质量、增加效益，特别是为了节约工业用粮，就需要运用基因工程手段^[2，3]，对目前耐高温生产菌株进行改造，使其能产生耐酸的高温α-淀粉酶，不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效益。

Habibi等已对来源于Bacillus licheniformis BLA、B .stearothermophilus BSA和B. amyloliquefaciens BAA等的一些高温α-淀粉酶的高效表达、酶分子改造以及热稳定性机理进行了广泛而深入的研究^[4]，但是这些α-淀粉酶的最适作用pH值都在5.5以上。随着一些耐热极端微生物得到分离培养，陆续分离得到十多种最适pH在4.0～5.5之间的高温酸性α-淀粉酶，其中最适温度在95℃以上且基因已经被克隆的酸性α-淀粉酶主要是从pyrococcus furiosus分离到的^[5]。

2002年Richardson^[6]从环境微生物DNA文库中克隆到的一个α-淀粉酶基因BD5063，可能来源于一种嗜热球菌Thermococcus sp. 。基因BD5063全长1299bp，编码433个氨基酸，蛋白质的理论分子量约49kD，肽链上不存在任何潜在N2连接糖基化位点。BD5063在荧光假单胞菌pseudomonas fluorescens获得表达，表达后的重组蛋白具有α-淀粉酶活性，最适pH5.0 ，最适温度105～110℃，活性依赖于Ca²⁺存在，是一种高温酸性α-淀粉酶，具有较大的应用潜力。

蔡恒^[7]等人将α-淀粉酶基因进行耐酸性改造后，以sacB基因的启动子和信号肽序列为基础，构建了诱导型表达载体，引入蛋白酶双缺陷型突变株DB104。实现了α-淀粉酶基因的分泌表达，且经过改造的α-淀粉酶基因的表达产物具有一定的耐酸性。本文在此基础上，尝试用大肠杆菌高效表达系统，对经过改造的α-淀粉酶基因进行表达，以提高其酶活力，为最终实现工业化生产奠定基础。

1　材料与方法

1.1　菌株与质粒

大肠杆菌JM109和BL21（DE3）分别为克隆和表达的宿主菌，克隆/表达载体pET-30a。所有质粒和菌株均为本实验室保存。质粒pUAMT为pUC19上克隆有1.9kb带有自身信号肽的地衣芽孢杆菌耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd（以未突变的耐高温α-淀粉酶基因amy为模板，成熟肽134位的L-亮氨酸变为L-精氨酸，320位的L-丝氨酸变为L-丙氨酸）重组载体，均由本实验室构建。

1.2　工具酶和试剂

Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA分子量标准和DNA片段的琼脂糖凝胶回收试剂盒等均购自Takara公司，卡那霉素、T4 DNA连接酶、蛋白质分子量标准等均购自上海生物工程有限公司，引物合成及测序由上海invitrogen生物工程公司完成。

1.3　培养基

LB液体培养基用于细菌培养。筛选培养基为含卡那霉素100μg/ml的LB/琼脂培养基。

1.4　DNA的提取及操作

质粒的快速提取及检测以及DNA的酶切、连接、大肠杆菌感受态的制备及转化按文献^[8]所述方法进行。

1.5　PCR扩增及重组质粒构建

根据地衣芽孢杆菌耐酸性高温α-淀粉酶突变基因，去除其自身信号肽，设计引物，上游引物P1： 5'-CATGCCATGGCTGCAAATCTTAATGGGACGCT-3' （下划线部分为加入NcoⅠ酶切位点） ，下游引物P2： 5'-CCCAAGCTTCCTGAGGGCTGATGACACTT-3'（下划线部分为加入的HindⅢ酶切位点） 。以提取的质粒pUAMT为模板扩增目的基因耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd。将PCR产物以及提取的质粒pET-30a，分别用NcoⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，利用电转化法转入大肠杆菌JM109中，通过卡那霉素抗性平板筛选转化子，然后对转化子质粒分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序。再将阳性转化子的质粒转入表达宿主菌BL21 （DE3）中诱导表达。

1.6　重组质粒pET-amyd的诱导表达

将构建好的工程菌株BL21/pET-amyd和对照菌BL21/pET-30a分别接种于2ml的LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养过夜，按1%的接种量转接于装有30ml培养基的250ml的三角瓶中继续培养3.5h，加入IPTG （终浓度为1mmol/L） ，30℃诱导表达。4h后，4000r.min^-1冷冻离心收集菌体，将菌体悬于pH6.0的磷酸缓冲液中，冰浴超声。超声波功率为400W，超声10次，每次10s，间隔2min。12,000 r.min^-1离心破碎液，分别取上清和沉淀用于SDS-PAGE，检测蛋白的表达情况。分离胶浓度为10%，浓缩胶的浓度为5%，考马斯亮蓝染色。

1.7　酶活检测

采用国标法QB/T2306-97分光光度法测定，酶活用u/ml （u/g）表示，1个酶活力单位定义为在70℃、pH6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量。吸取可溶性淀粉溶液（20g/L） 20.0ml和磷酸缓冲液（pH6.0） 5.0ml于试管中，在70℃恒温水浴中预热平衡3～5min。加入稀释好了的待测酶液（终酶浓度控制在65～70u/ml范围内） 1.00ml，立即用秒表记录时间，摇匀，准确反应5min。立即用自动吸管吸取反应液1.00ml，加到预先盛有0.1mol/L盐酸0.5ml和稀碘液5.00ml的试管中，摇匀。以0.1mol/L盐酸0.5ml和稀碘液5.0ml的混合液作试剂空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度（A） 。根据吸光度查表附录A （标准的附录） ，求得测试酶液的浓度（c） 。

X＝c×n×16.67

式中： X—样品的酶活力，u/ml （u/g） ； c—测试酶的浓度，u/ml； n—样品的稀释倍数；16.67—换算系数。

1.8　重组酶的性质分析

1.8.1　温度对酶活力的影响

（1）重组酶最适反应温度的测定：在不同温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）下测定重组酶液的酶活。以最高活力为100%，绘制温度曲线。 （2）重组酶的热稳定性测定：将两种重组酶液分别置不同温度（40℃、60℃、80℃、100℃）条件下保温2h，每20min取出，各自测定其残余酶活力，以未保温的酶液活力为100%，绘制温度稳定性曲线。

1.8.2　pH对酶活力的影响

（1）重组酶最适反应pH的测定：在不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）下测定重组酶液的酶活，以最高活力为100%，绘制pH曲线。 （2）重组酶的pH稳定性测定：将两种重组酶液在不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）条件下在70℃保温60min，各自测定其残余酶活力，以未处理的酶液活力为100%。绘制pH稳定性曲线。

2　结果与分析

2.1　质粒的提取及PCR扩增

以提取的质粒pUAMT为模板，扩增出的目的条带如图1所示。从图中可知，目的片段出现在1.6kb左右，大小与报道相符。

图1　PCR扩增结果

1:1kb DNAladder2:质粒pUAMTPCR产物（PCR product ofpUAMT）

2.2　重组质粒pET-amyd的构建

将PCR扩增得到的目的基因进行纯化，用NcoⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物再经纯化后，琼脂糖凝胶电泳检测。同时也将质粒pET-30a用NcoⅠ和HindⅢ进行双酶切，纯化，最后采用T4 DNA连接酶16℃过夜连接。重组质粒pET-amyd示意图如图2所示。

图2　重组质粒pET-amyd示意图

2.3　转化大肠杆菌

将构建的重组质粒pET-amyd转化大肠杆菌JM109，在含有卡那霉素的LB/琼脂平板上挑取阳性转化子，提取质粒分别用NcoI和NcoⅠ-HindⅢ进行单酶切和双酶切验证，电泳检测结果图3表明重组子质粒中带有目的基因amyd。

图3　pET-amyd重组质粒酶切图

1.1kb DNAladder 2. pET-amyd/NcoI/ HindⅢ3. pET-amyd/ NcoI

4. PCR产物（PCR product） 5. pET-30/ NcoI

2.4　序列测定

对重组质粒pET-amyd上的目的片段进行序列测定（上海invitrogen生物工程公司） ，所得到的基因全长为1568bp，利用软件DNAMAN将地衣芽孢杆菌耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd与突变之前的高温α-淀粉酶基因amy的氨基酸序列进行比对，如图4所示，上一行为amy的氨基酸序列，下一行为amyd的氨基酸序列，结果如下：

图4　amy与amyd的比对

结果表明，α-淀粉酶成熟肽134位的L-亮氨酸改为L-精氨酸，320位的L-丝氨酸改为L-丙氨酸，位点完全正确。

图5　各组分蛋白分析图

1： Marker，蛋白分子量标准（molecular weight standard）2： BL21/pET-amyd重组菌株破碎后上清（the supernatant ofBL21/pET-amyd） 3： BL21/pET-amyd重组菌株破碎后沉淀（the sedimentation of BL21/pETamyd）4： BL21/pET-30a对照菌株破碎后上清（the supernatant ofcontrol） 5： BL21/pET-30a对照菌株破碎后沉淀（the sedimentation ofcontrol）

2.5　amyd的诱导表达

将验证正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21 （DE3）中，进行诱导表达，分别对超声破碎后的上清液和沉淀进行SDS-PAGE，结果图5所示，在分子量大约为63，000kDa的位置泳道2比泳道4明显多出一条带，表达出蛋白的大小与报道^[9]的一致，说明amyd在大肠杆菌中成功获得了表达。另外，根据凝胶成像系统对蛋白进行分析表明，表达出的目的蛋白占细胞总蛋白的17%左右。从图5可知，目的蛋白都集中在超声破碎后的上清液，而离心后的上清液中则没有。

2.6　重组酶学性质的研究

2.6.1　酶的最适温度

基于国标QB/T2306-97的方法，在不同温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）下测定重组酶的酶活，amyd反应的最适温度均为80℃，在70℃到90℃之间相对酶活为90%以上，具有一定的耐热性。

图6　amyd的最适作用温度

2.6.2　酶反应的最适pH

在70℃下，按照国标法在不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）下测定重组酶的酶活，amyd最适pH为4.5，在pH4时相对酶活仍达到80%。

图7　amyd的最适作用pH

2.6.3　酶的热稳定性

取amyd重组酶液样品分别置不同温度（40℃、60℃、80℃、100℃）条件下保温2h，每20min取出，测定其残余酶活力，以未保温的酶活力为100%。由图8可见，这种酶的热稳定性比较好，在40～80℃保温120 min，酶活基本没有损失，残余酶活能保持在80%以上，100℃保温40min，没有酶活性。

图8　amyd的热稳定性

2.6.4　酶的pH稳定性

将amyd重组酶液样品在不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）条件下在70℃保温60min，测定其残余酶活力，以未处理的酶液活力为100%。由图9可见，重组酶amyd在pH 4.0～6.0范围内较稳定，，残余酶活为80%以上，pH 4.0时残余酶活为90%，具有很好的耐酸性。

图9　amyd的pH稳定性

3　讨论

耐酸性高温α-淀粉酶是酒精、味精及淀粉糖等工业淀粉液化过程中的关键酶。本项研究中，利用含有T7强启动子的pET-30a作为表达载体，以BL21 （DE3）作为宿主菌，实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd的高效表达，amyd是以高温α-淀粉酶基因为模板，成熟肽134位的L-亮氨酸变为L-精氨酸，320位的L-丝氨酸变为L-丙氨酸的突变基因。去除amyd基因本身的信号肽编码区，以确保表达产物能够被大肠杆菌分泌系统所识别。

研究发现，突变后α-淀粉酶的最适温度为80℃，在40℃到80℃时保温120min，酶活基本没有损失，氨基酸突变位点没有影响其耐热机制。突变后α-淀粉酶的最适pH为4.5，pH稳定范围为4.0-6.0，氨基酸突变位点使蛋白质的空间构象发生了变化，对耐高温α-淀粉酶的pH耐受性产生影响。从而证明，获得了既耐高温又耐酸的新型α-淀粉酶，为以后应利用定点突变技术等分子生物学手段改变现有某些酶的理化性质提供了可借鉴的成功先例。进一步探索将该新型突变α-淀粉酶基因采用合适的载体导入出发菌株地衣芽孢杆菌中，实现同源表达，利用该菌株天然的优良的分泌表达系统实现突变α-淀粉酶基因的高效表达，为最终工业化大生产奠定基础。

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