味精制备技术

味精制备技术_生物工艺学实验指

综合实验六　味精制备技术

一、背景知识

（一）味精简介

味精［Sodium（2S）-2-amino-5-hydroxy-5-oxo-pentanoate］又称味素，是调味料的一种，主要成分为谷氨酸钠。成品为白色柱状结晶体或结晶性粉末，是国内外广泛使用的增鲜调味品之一。

味精是采用微生物发酵的方法由粮食制成的现代调味品。

（二）主要成分

谷氨酸钠是一种氨基酸谷氨酸的钠盐，是一种无色无味的晶体，在232℃时解体熔化。谷氨酸钠的水溶性很好，在100mL水中可以溶解74g谷氨酸钠。

味精于1909年被日本味之素（味の素）公司所发现并申请专利。纯的味精外观为一种白色晶体状粉末。当味精溶于水（或唾液）时，它会迅速电离为自由的钠离子和谷氨酸盐离子（谷氨酸盐离子是谷氨酸的阴离子，谷氨酸则是一种天然氨基酸）。

（三）鲜味

味精通过刺激舌头味蕾上特定的味觉受体，比如说氨基酸受体T1R1/T1R3或谷氨酸受体，如：代谢性谷氨酸受体（mgluR4和mgluR1）以带给人味觉感受。这种味觉被日本人定义为鲜味，但是这种日式的鲜味和中国人熟知的五味中的鲜味有明显的区别。

（四）营养成分

营养素含量（每100g）热量（大卡）268.00，碳水化合物（g）26.50，脂肪（g）0.20，蛋白质（g）40.10，硫胺素（mg）0.08，烟酸（mg）0.30，镁（mg）7.00，钙（mg）100.00，铁（mg）1.20，锌（mg）0.31，铜（mg）0.12，锰（mg）0.67，钾（mg）4.00，磷（mg）4.00，钠（mg）8160.00（因味精为谷氨酸钠，所以钠含量最高），硒（μg）0.98。

二、实验简介

本实验选用谷氨酸发酵作为实验内容，主要考虑谷氨酸发酵为典型的代谢调控发酵，对其代谢途径和机制研究得较为透彻，可以让学生们用掌握的微生物和生物化学知识来理解、解释、预测发酵后的现象；其次，32h的发酵周期比较便于教学安排；同时，从培养基配制到味精原粉制备，是一个完整的综合性实训实验体系，通过这部分内容的学习和实践，使学生充分了解味精生产的完整工艺过程，可为学生今后从事氨基酸生产奠定理论和实践基础。

实验6-1　谷氨酸发酵技术

（一）实验目的

谷氨酸是最先成功地利用发酵法进行生产的氨基酸。谷氨酸发酵是典型的代谢调控发酵，其代谢途径相对研究得比较清楚。因此，了解谷氨酸发酵机制，掌握其发酵工艺，将有助于对代谢调控发酵的理解，有助于对其他通风发酵的理解和掌握，也有助于对已掌握的生化、微生物知识的融会贯通。

通过本次实验，掌握通风发酵的一般工艺，熟练掌握通用机械搅拌罐的设备使用。增强学生对谷氨酸生产的感性认识，培养学生的实践动手能力。

（二）实验原理

目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌等。谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和己糖磷酸支路（HMP途径）生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A（乙酰Co A），然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH＋4存在的条件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。

谷氨酸的生物合成受机体内复杂机制的调控。影响谷氨酸发酵过程的参数有很多，谷氨酸发酵过程主要受种子质量、培养基组成、温度、pH值以及供氧速率等因素控制。提取谷氨酸常用的工艺为等电点法和离子交换法。

（三）实验材料

1.菌种

谷氨酸生产菌可通过微生物研究所或发酵研究所选购。

2.主要设备

试管、角瓶、空培养皿、抽滤瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜、10L发酵罐及控制系统、螺杆式空压机（500t/M5n）、蠕动泵、水环式真空泵、恒温摇床、净化工作台、蒸汽发生器（45k W）、配料桶（10L）、搅拌机（50r/min）、旋转式蒸发器、生化培养箱等。

3.主要材料

淀粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、尿素、玉米浆、糖蜜、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、消泡剂等。

（四）实验方法与步骤

1.工艺流程

图1-6-1　味精生产工艺流程示意图

2.实验步骤

（1）菌种制备

菌种扩培顺序：斜面菌种→一级种子→二级种子。

①斜面种子的制备。

斜面培养基配方：葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0%，pH 7.0。

操作：按上述配方配制斜面培养基，加热，将融化的培养基分装到已消毒的空试管中，装量约为1/5，0.1MPa，30min灭菌，冷却至45℃摊成斜面。

检查：将制备好的斜面培养基37℃恒温培养24h，检查无菌后备用。

接种：将试管原种上的菌苔接种到新制斜面培养基上，37℃恒温培养24h，制成斜面菌种。

②一级种子制备。

培养基配方：葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.1%，玉米浆2.5%～3.3%，硫酸亚铁、硫酸锰各2×10-6（0.0002%），pH 7.0。

操作：用1000mL三角瓶装200mL培养基，8层纱布封口，0.1MPa灭菌30min，冷却后接入1/3支斜面菌苔，置摇床上30～32℃，转速170～190r/min培养12h。

一级种子质量标准：种龄12h，A（560nm吸光度净增值）＞0.5，RG（残糖）0.5%以下，pH 6.4±0.1。

③二级种子的制备。

培养基配方：葡萄糖2.5%，尿素0.34%，磷酸氢二钾0.16%，糖蜜1.16%，硫酸镁0.043%，消泡剂0.086mL/L，硫酸亚铁、硫酸锰各2×10-6（0.0002%），pH 7.0。

操作：配制方法同一级种子，0.1MPa灭菌10min，冷却后接种，接种量为10%（200mL培养基中接入一级菌种20mL），摇床培养7～8h；

二级种子的质量标准：种龄7～8h，pH 7.2，A560≥0.6，无菌检查：阴性，噬菌体检查：阴性。

④合并种子。

将每5瓶二级种子在无菌条件下合并在1000mL的抽滤瓶内（抽滤瓶先经0.1MPa 30min，空消），放入冰箱待用。

（2）噬菌体的检测

用试验样和敏感菌浇双层平板，在菌体生长过程中，如样品中有噬菌体，由于噬菌体的溶菌作用，会在平皿上留下透明的斑点（噬菌斑），通过噬菌斑的计数，即可评估噬菌体的污染程度。

①培养基配制。

底层平板培养基：葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0%，pH 7.0。

上层平板培养基：葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂0.7%，pH 7.0。

底层平板培养基和上层平板培养基分装2个三角瓶，纱布牛皮纸封口后0.1MPa灭菌30min。

②倒平板。

底层培养基溶解后倒平板，冷却凝固备用。

样品采集：如要测定无菌空气中的噬菌体样，可将上述底层平皿暴露在排气口30min。如测定液体样，则在上述底层平皿中加入适当稀释的样品1mL（无菌操作）。

取0.1mL谷氨酸生产菌菌液，加入上述已加样的底层平板上，后加5mL融化后冷却到45℃左右的上层培养基，混合均匀。待上层培养基冷却凝固后，放入培养箱37℃培养24h。

③计数。

观察并计数平板培养基上的噬菌斑，按照样品的稀释度（液体样品）或空气流量及暴露时间（气体样）计算污染的噬菌体浓度。

④计算。

（3）大肠杆菌（谷氨酸脱羧酶）酶粉的制备

谷氨酸脱羧酶是目前测定谷氨酸所必需的工具酶，酶法测定具有专一性高、反应灵敏等特点，较少受其他因素的干扰。

①菌种的培养。

先将菌种E.coli-TS在传代培养基上接种培养24h。

斜面培养基配方：牛肉膏1.0%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，琼脂1.7%，用50%氨水调pH 7.2，0.1MPa灭菌30min，摆成斜面。

②一级种子培养。

培养基配方：牛肉膏5.0%，蛋白胨1.0%，磷酸二氢钾0.25%（分消），用50%氨水调pH 7.1，用1000mL三角瓶装200mL，0.1MPa灭菌20min。

冷却后接种，1支斜面接一瓶一级种。接种后在摇床上36℃培养24h。摇床转速为170r/min。

③发酵培养基。

培养基配方：牛肉膏2.0%，蛋白胨1.5%，葡萄糖0.1%，玉米浆粉0.1%，磷酸二氢钾0.25%（分消），用50%氨水调pH 7.1。1000mL三角瓶装200mL，0.1MPa灭菌20min。冷却后接种，接种量5%，培养方式同上。

④收集菌体。

将摇瓶中的发酵液收集后，用冷却离心机离心，收集菌体，菌体用蒸馏水洗两次。

⑤制备冷冻干粉。

将菌体用少量蒸馏水制成菌悬液，加入10倍体积的冷冻丙酮（-18℃），搅拌均匀，真空抽滤，将滤下的菌体再用5倍冷冻丙酮搅拌均匀，真空抽滤。

将菌体加入5倍体积的冷冻乙醚（-18℃）脱水，抽滤后将菌粉放在干燥器内，放入冰箱，2d后将菌粉过筛，测定酶活性。

（4）谷氨酸发酵培养基的配制

按工艺要求配制发酵培养基，10L发酵罐定容7L，50L发酵罐定容35L，实际配料时，定容到预定体积的75%左右（即10L发酵罐定容7.5L），另25%容积为蒸汽冷凝水和种子液预留。

①发酵培养基配方：葡萄糖13%，硫酸镁0.06%，磷酸氢二钾0.1%，糖蜜0.3%，MnSO4和FeSO4各2×10-6，氢氧化钾0.04%，玉米浆粉0.125%，消泡剂0.01%，pH 7.0。实罐灭菌温度为115℃，30min。

②流加液制备：尿素配成质量分数为40%的溶液，装在1000mL的三角瓶中，每一瓶装800mL。分消备用。

③装料：打开罐盖上的加料口，将培养基原液加入发酵罐内。拧紧加料口螺母（注意：不要拧得太紧，否则会损坏密封圈）。

（5）实消

为了减少冷凝水的产生，实消开始时，先打开进夹套的蒸汽阀和夹套排水阀，并开启搅拌。当温度升到90℃时，关闭夹套进气阀，开启进发酵罐内的蒸汽阀进行直接加热，继续升温至工艺要求；升温过程需匀速搅动培养基，使培养基均匀升温，同时有利于降低灭菌时的噪音；灭菌过程中，应时刻注意罐压，并控制在0.08MPa之内，严禁超压。罐压的控制通过调节排气阀来实现。

注意在升温过程中不要开温控仪开关，否则当上、下限设定值设定在培养温度时，冷却水管中会自动通冷却水，不仅会影响升温速度、浪费蒸汽，更重要的是会引起蒸汽冷凝水过多，产生培养液浓度变化。实消时间一般为5min。实消结束后，关闭进气阀，用冷却水进行冷却。

当蒸汽阀门关闭以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐内压力降至0.03MPa时，必须开启空气进气阀，使无菌空气进入发酵罐内，使罐压保持在0.03～0.05MPa；当罐温降至70℃以下时，调节搅拌电机的调速器，慢速搅拌培养基，加快冷却速度；同时可稍开空气进气阀，调节排气阀，使罐压保持在（0.03～0.05）MPa。

加初尿素：发酵液冷却至40℃左右时，通过蠕动泵加第一次尿素，添加量为0.6%～1.0%（添加量按菌种的脲酶活性大小和菌体同化能力的大小而定）。

（6）接种

①火焰封口法。先缓慢将罐压降低到0.01MPa，关小进、排气阀，在接种口上绕上酒精棉点燃，用钳子逐步打开罐顶接种口，并将盖放置在有75%酒精的培养皿内，防止污染。将二级种子液在火焰封口下倒入发酵罐内，盖上接种阀，旋紧。

②压差接种法。操作步骤：第一步，将罐顶流加口在火焰封口下连接到装有菌种的抽滤瓶侧口管道上；第二步，将发酵罐压力加大到0.1MPa，打开流加口阀，使发酵罐和菌种瓶的压力平衡后，关闭流加阀；第三步，打开发酵罐排气阀，使发酵罐压力下降到（0.01～0.02）MPa（不能降为0），关闭排气阀，使发酵罐和菌种瓶间形成压力差；第四步，打开流加口阀，依靠压力差将菌种液压入发酵罐；第五步，重复第二步到第四步的操作，直到将所有菌种都压入发酵罐为止。注意：由于抽滤瓶带压作业，为安全起见，要选用优质的抽滤瓶，并在瓶外加上帆布瓶套，防止意外砸瓶伤人。

③流加接种法。操作步骤：实罐消毒时在流加口上套上相应口径的80～100cm长的蠕动泵专用硅胶管，并在另一头用8层纱布包扎。在实消时一起消毒；接种时，将纱布解除，迅速将硅胶管插入菌种瓶中，瓶口仍用纱布封口；用蠕动泵将菌种液压入发酵罐。

（7）发酵过程的控制

①发酵过程的温度控制。谷氨酸发酵0～12h为长菌期，最适温度在30～32℃，发酵12h后，进入产酸期，控制温度为34～36℃。由于发酵期代谢活跃，发酵罐要注意冷却，防止温度过高引起发酵迟缓。

②发酵过程中的pH控制。发酵过程中产物的积累导致pH下降，而氮源的流加（氨水、尿素）导致pH升高，发酵中，当pH降到7.0～7.1时，应及时流加氮源。

长菌期（0～12h）控制pH≤8.2（由尿素流加量、风量和搅拌转速来调节）。

产酸期（12h以后）控制pH在7.1～7.2。

控制pH的手段主要有：控制风量和控制流加氮源。

放罐：达到放罐标准后，及时放罐。

放罐标准：残糖在1%以下且糖耗缓慢（＜0.15%/h）或残糖＜0.5%。

（8）发酵过程的分析

发酵过程中，按表1-6-1频次测定、记录下列指标：pH，通风量，还原糖，A560、温度（1次/h）；谷氨酸（1次/4h），发酵12h起。

表1-6-1　谷氨酸发酵实验操作记录

（9）谷氨酸提取与精制

①谷氨酸等电提取流程。

图1-6-2　谷氨酸等电提取流程

②等电操作。

将放罐的发酵液先测定放罐体积、pH、谷氨酸含量和温度，开始搅拌。若放罐的发酵液温度高，应先将发酵液冷却到25～30℃，消除泡沫后开始调pH。用盐酸调pH 5.0（视发酵液的谷氨酸含量高低而定）；

当pH达到4.5时，应放慢加酸速度，在此期间应注意观察晶核形成的情况，若观察到有晶核形成，应停止加酸，搅拌育晶2～4h。若发酵不正常，产酸低于4%，虽调pH到4.0，仍无晶核出现，遇到这种情况，可适当将pH降至3.5～3.8；

搅拌2h，以利于晶核形成，或者适当加一点晶种刺激起晶；

搅拌育晶2h后，继续缓慢加酸，耗时4～6h，调pH至3.0～3.2，停酸复查pH，搅拌2h后开大冷却水降温，使温度尽可能低；

达到等电点pH后，继续搅拌16h以上，停止搅拌静置沉淀4h，关闭冷却水，吸去上层菌液，至近谷氨酸层面时，用真空将谷氨酸表层之菌体和细谷氨酸抽到另一容器里回收。取出底部谷氨酸，离心甩干。

③谷氨酸钠的精制流程。（图1-6-3）

图1-6-3　谷氨酸钠的精制流程

④谷氨酸钠的精制操作。

湿谷氨酸：水∶纯碱∶活性炭＝1∶2∶（0.3～0.34）∶0.01，T＝60℃，pH＝6.4（用试纸测）；在不锈钢桶内加入清水及活性炭升温到65℃，开动搅拌（60r/min）；投入谷氨酸；缓慢、逐步加入碳酸钠中和到pH 6.4（试纸），调整中和液浓度至21～23Be；加热至65℃，继续搅拌。

⑤谷氨酸钠的浓缩结晶。

将澄清的脱色液（18～20Be/35℃）加入旋转式蒸发器（加料小于1/2），真空度要求在80k Pa以上，温度小于70℃，浓缩至34～34.5Be/80℃，升温到80℃放料。放料后冷却，搅拌2～3h后开冷却水温度，降温到比室温高15℃。

分离：抽滤（工业滤布作介质）。

烘干：鼓风干燥箱（温度小于60℃）干燥，即可得到味精原粉。

（五）实验注意事项

1.菌种的污染，势必导致发酵的失败，轻者产酸量下降，严重的不积累产物，因此，在菌种制备的整个过程中，都要树立牢固的无菌概念，工作力求细致、到位。

2.空消允许蒸汽直接进入发酵罐，但同时必须注意要将夹套接通大气，防止高温产生的高压将夹套挤破。蒸汽温度高，当心烫伤。

参考文献

［1］陈卓贤，沈春明，陈国良.味精生产工艺学［M］.北京：中国轻工业出版社，1990.

［2］吴根福.发酵工程实验指导［M］.北京：高等教育出版社，2006.

［3］陈坚.发酵工程实验技术［M］.北京：化学工业出版社，2009.

［4］李艳.发酵工业概论［M］.北京：中国轻工业出版社，1999.

［5］孙俊良.发酵工艺［M］.北京：中国农业出版社，2008.

（编者：蒋新龙）