从牛乳中分离提取酪蛋白和乳糖

Separation and Extraction of Casein and Lactose from M ilk

【目的要求】

1．了解从牛乳中分离提取酪蛋白和乳糖的原理及操作方法。

2．掌握结晶、减压过滤等操作方法。

3．学会酪蛋白和乳糖的鉴定方法。

【基本原理】

酪蛋白是牛奶［1］中的主要蛋白质，并以酪蛋白钙胶束形式［2］存在，其浓度约为35 g/L。蛋白质也是两性化合物，当调节牛乳的pH值达到酪蛋白的等电点(p I)4．6左右时，酪蛋白的溶解度最小，从牛乳中析出。

酪蛋白—Ca2++H→+酪蛋白↓+Ca2+

牛乳经脱脂和去掉蛋白质后，所得溶液即为乳清。乳清内含有的糖类物质主要为乳糖，乳糖是一种还原性二糖，它的水溶液有变旋光现象，达到平衡时的比旋光度是+53．5°。乳糖不溶于乙醇，在乳清中加入乙醇，乳糖即可结晶析出。酪蛋白的鉴定可通过电泳或蛋白质的颜色反应;乳糖则可通过旋光仪、薄层色谱(TCL)或糖脎的生成来鉴定。

【仪器与试剂】

仪器:离心机、旋光仪、熔点仪、水浴锅。

试剂:去脂牛乳、醋酸溶液(1 9)、95%乙醇、1 1(V V)的乙醇－乙醚混合液、乙醚、0．4 mol/L NaOH的生理盐水、5%NaOH、1%硫酸铜、浓硝酸、茚三酮。pH试纸，蒸发皿。

【实验内容】

1．牛乳中酪蛋白的分离与鉴定

(1)酪蛋白的分离取50 mL去脂牛乳置于150mL烧杯内，在水浴锅中小心加热至40℃，保持温度，边搅拌边慢慢滴加醋酸溶液(1 9)，即有白色的酪蛋白沉淀析出，继续滴加稀醋酸溶液，直至酪蛋白不再析出为止(约加2 mL)，混合液的pH值为4．6［3］。冷却到室温，将混合物转入离心杯中，3000 r/min离心15 min。上清液经漏斗过滤于蒸发皿中，作乳糖的分离与鉴定。沉淀(酪蛋白)转移至另一烧杯中，加95%乙醇20 mL，搅匀后用布氏漏斗抽气过滤，以1 1(V V)的乙醇－乙醚混合液小心洗涤沉淀2次(每次约10 mL)，最后再用5 mL乙醚洗涤1次，吸滤至干。将干粉铺于表面皿上，烘干，称重并计算牛乳中酪蛋白的含量。

取0．5 g酪蛋白溶于0．4 mol/L NaOH的生理盐水5 mL中，用于蛋白质的颜色反应。

(2)酪蛋白的颜色反应

1)缩二脲反应在一支小试管中加入酪蛋白溶液5滴和5%NaOH溶液5滴，摇匀后加入1%硫酸铜溶液1～2滴［4］。振摇试管，观察颜色变化。

2)黄蛋白反应在一支小试管中加入酪蛋白溶液10滴和浓硝酸3滴，水浴中加热，生成黄色硝基化合物。冷却后再加入5%NaOH溶液15滴，溶液呈橘黄色。

3)茚三酮反应在一支小试管中加入酪蛋白溶液10滴，然后加茚三酮试剂4滴，加热至沸，即有蓝紫色出现。

2．乳糖的分离与鉴定

(1)乳糖的分离将上述实验中所得的上清液(即乳清)置于蒸发皿中，用小火浓缩至5 mL左右，冷却后，加入95%乙醇10 mL，冰浴中冷却，用玻璃棒搅拌摩擦，使乳糖析出完全，经布氏漏斗减压过滤，用95%乙醇将乳糖晶体洗涤2次(每次5 mL)，即得粗乳糖晶体。

将粗乳糖晶体溶于8 mL的50～60℃的热水中，滴加乙醇至产生浑浊，水浴加热至浑浊消失，冷却，过滤，用95%乙醇洗涤晶体，干燥后得含一分子结晶水的纯乳糖。

(2)乳糖的变旋光现象精确称取1．25 g乳糖用少量蒸馏水溶解，转入25 mL容量瓶中定容，将溶液装入旋光管中，每隔1min测定1次，至少测定6次，8 min内完成，记录数据。10min后，每隔2min测定1次，至少测8次，20min内完成。记录数据并计算比旋光度。

本实验约需4 h。

【注释】

［1］牛乳的平均百分组成为:水87．1%、蛋白质3．4%、脂肪3．9%、糖4．9%、矿物质0．7%。

［2］酪蛋白是一种磷蛋白，蛋白质肽链中丝氨酸、苏氨酸残基的羟基和磷酸结合，并以钙盐形式存在。酪蛋白是一种混合物，由α、β和κ酪蛋白三种组成。在牛乳中三种酪蛋白均为钙盐，并形成胶束。α和β－酪蛋白钙盐胶束不溶于牛乳，但κ－酪蛋白溶于水，并可增溶α和β－酪蛋白，构成溶于水的酪蛋白胶束。

［3］酪蛋白的等电点(p I)为4．6，在做酪蛋白分离时，加醋酸溶液要慢，控制溶液的pH值在4．6附近，否则酪蛋白沉淀不充分。

［4］硫酸铜不能加多了，否则产生蓝色的氢氧化铜沉淀，干扰实验现象的观察。

实验指导

【预习要求】

1．复习等电点的概念及蛋白质在等电点时的特性;复习蛋白质的性质、颜色反应。

2．了解旋光仪的构造与使用方法;熟悉乳糖的结构与性质。

【注意事项】

1．酪蛋白的颜色反应，可根据实验时间的安排，选做1～2个。

2．在使用旋光仪时，切不可将旋光管随意放在实验桌上，以免滚落地上摔碎。

【思考题】

1．为了将牛乳中的酪蛋白尽可能多地沉淀析出，应控制pH在什么范围?为什么?

2．为什么乳糖具有变旋光现象?

(编写:王微宏　校核:罗一鸣)