子任务三 活性蛋白质的提取工艺
一、大豆蛋白提取
(一)碱溶酸沉法提取大豆蛋白
1.提取工艺
豆粕→浸泡→调溶液pH8.0→离心取沉淀→调pH为4.5→离心取沉淀→调pH为7.0使沉淀溶解→调pH至2.8～3.8→加入壳聚糖乙酸溶液→水热处理→喷雾干燥→成品。
2.工艺要点
(1)浸泡:称取低温豆粕100g，加入去离子水1.5L，搅拌均匀后浸泡10h。
(2)调溶液pH8.0、离心:用1mol/LNaOH溶液调pH值酸度为8.0，搅拌1.5h后以9 000r/min的速度离心20min，弃去上清液。
(3)调pH为4.5、离心:往沉淀中加入6mol/L柠檬酸溶液调pH值至4.5，搅拌15min，以9 000r/min的速度离心20min，弃去上清液。
(4)调pH为7.0:在沉淀中加入10倍的去离子水，调整pH值为7.0，待沉淀完全溶解后调pH为2.8～3.8。
(5)加入壳聚糖:在调节好pH的溶液中加入在5%(w/w)的再醋酸溶液中溶解的壳聚糖。
(6)水热处理:将上述溶液在100℃～120℃的恒温水浴中处理15min。
(二)双酶复合法提取大豆蛋白
1.提取工艺
脱脂豆粕→脱糖→离心分离→滤渣→酶解(双酶)→离心分离→滤液→浓缩干燥→成品。
2.工艺要点
(1)称量:用架盘天平称取经过35目筛子筛选的大豆豆粕粉100g，加一定量蒸馏水将其溶解。
(2)脱糖:用1mol/L盐酸溶液调节溶液pH值，调节到大豆蛋白的等电点，pH值为4.5左右，在45℃的恒温水浴锅中恒温洗糖60min，然后以3 400r/min离心分离15min，将沉淀物再次搅拌溶解，再用盐酸调节pH为值4.5，恒温45℃洗糖30min，然后再以3 400r/min的速度离心分离，将溶解出的糖类物质分离出来，将上清液干燥测定糖分含量，沉淀再次溶解。
(3)酶解:取离心所得沉淀100g加入800mL蒸馏水配成一定浓度的溶液，并缓慢加入1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值到7.1，在45℃下加热搅拌，酶解选用胰蛋白酶和高效蛋白酶。将25mL蒸馏水溶解的0.1g胰蛋白酶加入溶液酶解3h，然后加入25mL蒸馏水溶解的0.1g高效蛋白酶加入溶液中酶解7h。
(4)离心分离:将酶解后的溶液以3 400r/min的速度离心分离，取上层液，即可得酶解产物。
(5)酶灭活:将酶解产物放入真空干燥箱中，升温至85℃，加热10min，使酶失去活性。
(6)离心分离:将酶解后的溶液以3 400r/min的速度离心分离，取上层液，即可得酶解产物。
(7)水洗:将离心分离后的残渣以一定的pH值水洗2～3次，进一步提取多肽等蛋白质，残渣干燥做分析用。
(8)干燥:将真空干燥箱温度设置在70℃，直到压力为0.05MPa，真空泵抽滤干燥，即可获得浅黄色、黄色或黄褐色的酶解产物。
二、乳铁蛋白的提取
(一)离子交换色谱法提取乳铁蛋白
1.提取工艺
原料乳过滤→脱脂→离子交换层析→洗脱液→超滤浓缩→冷冻干燥。
2.工艺要点
(1)脱脂:使用冷冻离心机在－4℃～4℃进行离心脱脂30min。
(2)离子交换:离子交换层析采用Bio-Red的BiologicLP系统(柱型1.6cm×50cm)，脱脂乳以300mL/h的流速在4℃条件下动态上柱吸附8h。
(3)先用去离子水以200mL/h的流速进行平衡，约10h。然后用质量分数为1.5%的NaCl洗脱，约5h，待杂蛋白被洗脱下来，基线再度走平后，使用质量分数为5.0%的NaCl溶液再次洗脱，洗脱产物即为乳铁蛋白，出峰时间为1h左右。
(4)超滤浓缩:利用Labscale TFF System(Millipore，USA)，采用截留相对分子量为5 000的聚砜膜的超滤膜。
(5)冷冻干燥:利用真空冷冻干燥及在－55℃条件下冷冻干燥。
(二)超滤法提取、分离及纯化乳铁蛋白
1.提取工艺
牛初乳→超滤→杂蛋白分离→乳铁蛋白分离→透析→乳铁蛋白纯化。
2.工艺要点
(1)超滤。取1 000mL牛初乳，先用截流分子量为100 000Da的超滤膜(CA膜)在板式超滤器中首次超滤，超滤压力为0.15MPa，料液温度为40℃。然后用截流分子量为50 000Da的超滤膜对滤过液进行第二次超滤，最后用截流分子量为10 000Da的超滤膜进行浓缩，即得乳铁蛋白粗品。
(2)杂蛋白分离。通过超滤得到的乳清浓缩液中，除了乳铁蛋白之外，还含有杂蛋白，因此需要用盐析法将其分离出去，并要确保所分离的杂蛋白中不含乳铁蛋白。在这个过程中，盐的浓度是考虑的唯一因素。
在上述得到的乳铁蛋白粗品中加入适量硫酸盐缓冲液(pH值8.5)，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，使其浓度达到50%，于室温下静置过夜，于10 000r/min下离心30min，沉淀物即为杂蛋白。
(3)乳铁蛋白分离。在上述去除杂蛋白的离心液中滴加饱和硫酸铵溶液，直至其浓度达到80%，保持温度为30℃，pH值为8.5的条件下静置过夜，于10 000r/min下离心30min，沉淀物即为乳铁蛋白。
(4)透析。将盐析得到的沉淀溶于2mL蒸馏水，注入5%火棉胶制成的透析袋，将透析袋置于500mL蒸馏水中，在30℃恒温水浴箱内透析2d，中间将透析环境中的蒸馏水更换3次，用BaCl2检测透析液，无白色沉淀则表明透析完成。
(5)纯化。取透析液2mL上SephadexG－100层析柱(1.0×39cm)，进样量为2mL。洗脱剂为PBS，缓冲液(磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲溶液) pH值为7.4，其中含有0.65mol/L的NaCl，洗脱流速为2mL/min，淋洗液即为纯品乳铁蛋白。
三、金属硫蛋白的提取
(一) Cd诱导法提取金属硫蛋白
1.Cd－MT的诱导
选取健康的鲤鱼，放入含Cd2+(10mg/L)金属离子浓度进行批量诱导，诱导时间为2周，期间不喂食，之后解剖取肝、肾、腮、心脏和脑以备提取用，－20℃冷冻。
2.Cd－MT的提取与分离
在提取工艺中，MT的提取大致可分为匀浆与除杂两步。
(1)匀浆:称取100g内脏组织加入一定体积4℃预冷的Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH值为8.6，内脏组织与缓冲液的质量体积比为1/2，在此条件下MT在缓冲液中的溶出量达到最大。匀浆液在10 000r/min、4℃条件下离心30min，弃沉淀，取上清液备用。
(2)除杂
将上清液置85℃水浴中热变性5min，再次除去杂蛋白，然后用冰水冷却，用8层纱布过滤，取清液，静置约2h，然后在8 000r/min、4℃条件下离心10min，弃沉淀，取上清液，得到所要的匀浆液，记下体积(V)，精确到1mL。
3.冷冻干燥
所得上清液在真空冷冻干燥机中干燥，保存。
(二)化学法提取金属硫蛋白
玉米种子浸种后放于白瓷盘中在25℃下水培发芽生长，待长出2～4片叶子时，称取叶片1～2g，并用剪刀剪碎。加入10mL 0.1mol pH8.6的Tris-HCl缓冲液，用电动玻璃匀浆器在冰浴条件下充分搅浆，匀浆液放于4℃浸提5～8h后4℃12 000r/min离心15min;收集上清液，并于100℃水浴加热5min，然后4℃12 000r/min离心10min，弃去沉淀，上清液中加入3倍体积无水乙醇于－20℃下过夜沉淀;取出沉淀物于4℃12 000r/min离心15min，取上清液，视产生沉淀量的多少，加入1～2 mL0.01mol/L Tris-HCl缓冲液室温溶解2～4h，然后于12 000r/min离心20min收集上清液，此即为金属硫蛋白粗提取液。
四、免疫球蛋白的提取
(一)牛初乳中免疫球蛋白的提取
1.提取工艺
牛初乳→预处理→20%硫酸铵溶液盐析→50%硫酸铵溶液盐析→35%硫酸铵溶液盐析→粗提物稀释→免疫球蛋白G含量和纯度的测定。
2.工艺要点
(1)预处理:将牛初乳原料在40℃下加热，再用两层纱布过滤一次，然后用四层纱布过滤一次，再用乳脂分离机分离两次后再用四层纱布过滤1次。用1mol/L的HCl将pH值调至4.6后室温静置30min，再4 000r/min离心20min，取上清液，得到除去酪蛋白的牛初乳原料在－20℃下冷冻贮藏备用。
(2)将经过预处理的牛初乳解冻后取10mL，加入pH7.0、0.01mol/L的PBS缓冲液10mL，再加入5mL饱和硫酸铵，以4 000r/min离心20min，离心后保留上清液，此时的沉淀主要为纤维蛋白，弃去。
(3)将离心后的上清液与等体积的饱和硫酸铵混合，使硫酸铵浓度为50%，4 000r/min离心20min，弃去离心后的上清液，这时得到的沉淀为很少量的白蛋白及大多数拟球蛋白。
(4)将沉淀用pH7.0、0.01mol/L PBS缓冲液10mL溶解后，加入一定体积的饱和硫酸铵，使硫酸铵浓度为35%，用0.1mol/L的HCl和NaOH将pH值调至7.4，在40℃恒温水浴锅中静置30min后再在4 000r/min下离心20min;离心后弃上清液，将沉淀重复上一步操作，此时得到的沉淀主要成分为免疫球蛋白G。
进行以上三步操作时要注意:①加饱和硫酸铵溶液时，应在搅拌下缓慢滴入，以防局部硫酸铵浓度过高，引起其他无关蛋白的共沉。②只有在溶液中蛋白含量＜10mg/mL时，方可一次将硫酸铵溶液加入。③盐析后搅拌40min到1h再在水浴中放置一段时间。④将离心后的沉淀用PBS缓冲液或蒸馏水溶解时要搅拌至沉淀完全溶解，但是搅拌速度不能太快，以免蛋白质起泡而变性。
(二)猪血中免疫球蛋白(Ig)的提取
猪血→猪血清→加入50%硫酸铵饱和溶液沉淀→Ig粗品→加蒸馏水转移→超滤→透析→Ig纯品。(三)蛋黄中免疫球蛋白的提取提取工艺流程图见5－1。
图5－1 蛋黄中免疫球蛋白的提取工艺
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