植物叶片总蛋白的提取

实验十三　植物叶片总蛋白的提取

一、实验目的

了解植物总蛋白的提取方法，掌握植物总蛋白提取的基本原理并熟练实验操作技术。

二、实验原理

生物体内蛋白质由于其氨基酸组成、结构、大小、形状、电荷、等电点、电荷分布、疏水性、溶解度、密度、配体结合能力、金属结合能力及热稳定性等决定了分子作用类型，都是选择提取和分离方法的依据。用来分离纯化蛋白质的方法很多，有沉淀法、离心法、电泳法、层析法等。在实施蛋白质提取和纯化的实际操作中，根据目标蛋白质的不同，采用的方法或方法的组合也不同。

生物体蛋白质提取的第一步是从组织中将蛋白质游离出来，获得组织提取液，即总蛋白质的提取。因此首先涉及的是组织和细胞的破碎，其方法有多种，本实验采取低温研磨的方法破碎组织。

提取缓冲液的pH值是一个重要参数，应选择蛋白质能够溶解的pH值范围。包括远离pI的pH，避开极端pH值。选择能够覆盖相应pH值范围的恰当缓冲液。缓冲液浓度在20～50mmol/L。离子强度是决定蛋白质溶解性的另外一个重要因素，目标蛋白质不同，要求也不同，应具体情况具体分析。金属离子螯合物用于去除Hg²⁺，Zn²⁺，Pb²⁺等重金属离子，蛋白质会与重金属离子作用沉淀，溶液呈粘状。EDTA是很好的螯合剂，但在pH7以上溶解，应在调节pH值前加入缓冲液。由于蛋白质上某些位点会被氧化，要加还原剂。常用的有二硫苏糖醇和二巯基乙醇，前者较后者还原力更强，价格贵些。一般还原剂浓度在1～10mmol/L。另外还需加蛋白酶抑制剂。EDTA能够封阻金属蛋白酶，苯甲基磺酰氟(PMSF)可以抑制丝氨酸蛋白酶，但是醇溶性化合物。蛋白质在常温下比低温下更容易溶解，高温下容易发生水解氧化等不利反应，固常在常温下提取。但为了避免蛋白质降解，很多情况下是在低温下提取。提取液中的蛋白质常用有机溶剂沉淀的方法与溶液分离。

聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)因为分子具有酰胺键及吸附多酚分子上的氢氧基从而形成氢键，可以去除酚类物质。

本实验采用Tris-HCl缓冲液提取，丙酮沉淀的方法制备植物总蛋白的粗提物。

三、实验仪器、材料和试剂

1.仪器:研钵，离心管，枪头，微量移液器，紫外分光光度仪，高速冷冻离心机。

2.材料:植物嫩叶。

3.试剂:Tris-HCl提取缓冲液:30mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，5mmol/L MgCl₂，12mg PVP/0.5mL(研磨时加入)。

四、实验步骤

1.称取花生茎或叶0.5g，剪碎，置于－20℃预冷的研钵中。

2.加入2.5mL Tris-HCl提取缓冲液，冰上研磨成匀浆。

3.取1mL剪头的枪头将匀浆从研钵吸取到冰上的1.5mL离心管中，4℃5000rpm离心10min(如果转速更高、时间更长也可以，得到的蛋白质含量不同)。

4.吸取200μL上清液分装在1.5mL离心管中，加入1mL丙酮(含10mmol/L二巯基乙醇)，混匀，－20℃沉淀1h。

5.沉淀以10000rpm离心10min，弃上清液。沉淀用80％丙酮洗两次后(每次10000rpm离心3min)在室温干燥5～10min，－20℃保存备用。

6.另从第三步的上清液中取样1～20μL，加到2mL的30mmol/L Tris-HCl缓冲液中，放在比色皿中，测OD₂₆₀和OD₂₈₀，记录数据(如果比色皿是2mL容量，样品取量根据浓度而定，使OD值在0～1之间)。

7.根据公式计算蛋白质浓度:

OD₂₈₀/OD₂₆₀＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式:

比色皿中溶液蛋白质含量(mg/mL)=1.45OD₂₈₀－0.74OD₂₆₀

OD₂₈₀/OD₂₆₀＞1.5时，用Lambert-Beer定律:

比色皿中溶液蛋白质含量(mg/mL)=OD₂₈₀/KL

=(OD₂₈₀/6.3×1)×10g/L

K:摩尔消光系数

实验需要约3h。

五、结果与分析

以单位重量材料中所含蛋白质重量来计算材料中蛋白质的含量。

六、注意事项

研磨后用剪口枪头取样。离心后要取上清液，避免将细胞碎片带入。

七、思考题

本实验用Tris-HCl缓冲液提取蛋白，如果用NaCl或者硫酸铵溶液提取是否可以提到蛋白质?为什么?