真核细胞总的分离提取

第二节　真核细胞总RNA的分离提取

RNA是基因表达产物，由以下几类分子组成，即rRNA（占细胞总RNA的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10%～15%）、mRNA（占1%～5%）。其中mRNA是分子生物学的主要研究对象，分离制备mRNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。

真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

一、RNA提取的关键

真核细胞RNA的提取过程有4个关键点：①样品（细胞或组织）的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离；其中最关键的是抑制RNA酶活性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。

二、组织RNA提取的基本步骤

1．仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。

2．试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。

3．主要步骤

（1）取组织50～100mg，加0．8ml Trizol冲洗匀浆器，移入同一离心管，冰上静置5min。

（2）加0．2ml氯仿，充分震荡混匀，静置3min，4℃，12 000g×15min离心。弃沉淀。

（3）取上清液，加入0．5ml异丙醇，颠倒混匀。－20℃静置2h，4℃，12 000g×10min离心。

（4）弃上清液，取沉淀，加入1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7 500g×5min离心。

（5）弃上清液，沉淀真空干燥10min。

（6）加40μl DEPC溶液，充分溶解RNA。

4．结果鉴定

（1）紫外分光光度计检测：取RNA溶解液，按一定比例稀释后，紫外分光光度计测定260nm、280nm A值，计算A₂₆₀/A₂₈₀比值，如果比值在1．7～2．0∶1之间，说明RNA纯度可。

标准样品当A₂₆₀＝1时，RNA浓度约为40μg/ml，根据下述公式计算RNA浓度：RNA浓度（μg/ml）＝A₂₆₀×稀释倍数×40。

（2）电泳检测：1%甲醛变性胶电泳观察RNA质量，电泳槽及制胶板先用3%过氧化氢浸泡过夜；制1%甲醛变性凝胶板：4．5μl RNA，2μl 5×甲醛胶电泳缓冲液，3．5μl 37%甲醛，10μl甲酰胺，离心混匀，65℃变性15min后，迅速置冰浴中；再加入2μl RNA上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm电压，电泳1～2h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的18S、28SRNA电泳带，无大量小分子RNA，说明RNA无明显降解，样品－70℃保存备用。

三、注意事项

1．所有玻璃器皿160～180℃高温干烤6h以上，非耐高温器皿经0．1% DEPC液浸泡后，经高温（15磅，20min）处理灭活RNA酶，所用试剂均用DEPC水配制，然后高压处理。

2．实验用水要经DEPC处理，但含Tris的试剂不能用DEPC处理。

3．实验操作过程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。