雄性细胞的分离

从严格意义上讲，性细胞是指直接参加受精作用的雌、雄配子，即精细胞与卵细胞。但就被子植物而言，精细胞与卵细胞的分离往往要从花粉与胚囊的分离入手，而且花粉与胚囊作为参与整个受精过程的单位具有明显的性特征，故将其也纳入广义的性细胞范畴。因此，雌、雄性细胞的分离可根据性质是否相近分成3类：

1）花粉原生质体的分离

花粉粒被花粉外壁与内壁所包围，用人工方法脱去外壁和内壁，可分离出仅有质膜保护的花粉原生质体。花粉原生质体兼有花粉与单倍性原生质体双重特性，具有重大研究价值。20世纪80年代中后期，探索出了3条分离花粉原生质体的路径：①化学脱壁，用氧化剂、酸、碱、多糖试剂等多种化学试剂处理花粉外壁，但易导致原生质体受损；②非酶法脱壁，据报道，用NaCl溶液滴加菜豆成熟花粉，能迅速释放出原生质体，但并未提供脱壁是否彻底的证据；③酶法脱壁，花粉原生质体的酶解脱壁与体细胞原生质体分离时直接降解是不同的。花粉壁外壁的基本成分是孢粉素，是类胡萝卜素与类胡萝卜素酯的氧化多聚化的衍生物，性质十分坚固，至今尚无酶能加以降解。内壁的基本成分是纤维素与果胶质，可被常规细胞壁降解酶分解。

外壁是分离花粉原生质体的主要障碍。因此，需避开外壁，降解内壁，促使原生质体分离。脱外壁花粉的分离主要是设法削弱与切断外壁与内壁的联系，使外壁脱落。目前有3种方法：

（1）低渗水合法。将花粉置于低渗溶液中水合，使外壁脱落。

（2）花药预培养法。此法与分离烟草幼嫩花粉原生质体方法相近，也经过花蕾低温预处理—花药漂浮培养—酶解3个步骤。不同之处在于酶解时间大大缩短。酶解的作用是将裂开的外壁与内壁之间尚存的局部联系彻底切断，从而分离出脱外壁花粉。

（3）低温水合—热激—渗激法。热激与渗激促使外壁裂开以致脱落。低温与热激所用温度、时间以及水合液、低渗液的渗透压均能影响分离效果。该法能较好地保持脱外壁花粉生活力，显著促进萌发。

降解内壁目前大致有4种分离方法：

（1）一步酶解法。该法适用于具宽大萌发沟花粉的植物。花粉置于酶液中，通过水合膨胀，使外壁沿萌发沟裂开，内壁大面积暴露，在酶作用下分解，释放出原生质体。

（2）水合-酶解二步法。在上述工作基础上，将水合与酶解分成两个步骤。第一步花粉在溶液中充分水合，使外壁裂开。第二步转入酶液，降解内壁，获得原生质体。

（3）萌发-酶解二步法。用上述方法不能分离烟草等植物的花粉原生质体，后建立此法：第一步将成熟花粉置于花粉培养基中，待花粉大量萌发，长出短花粉管时，及时转入第二步，在酶液中酶解。由于花粉管尖端的壁为果胶质与纤维素等物质组成，酶液可开始降解花粉管壁，再扩展至花粉管内壁，从而释放出原生质体。需要注意控制花粉管长度，过长时，易导致亚原生质体的生成。

（4）花药预培养法。分离烟草幼嫩花粉原生质体时可用此法。该法包括3个步骤：第一步将花蕾进行低温预处理。第二步收集花药，将之漂浮在液体培养基上，培养中花药裂开，花粉释放至培养基中，在继续培养过程中大量花粉的外壁破裂。第三步将破裂外壁花粉转入酶液。

一般情况下，不同的花粉发育时期，花粉的形态结构与生理状态均有变化，因此，分离方法与效果也可能因之变化。分离方法及各种细节也影响分离效果，如酶的种类、浓度及酶解时间等。

2）生殖细胞与精细胞的分离

生殖细胞与精细胞位于花粉粒或花粉管内，沉浸于营养细胞的细胞质中，以“细胞中的细胞”状态存在。因此，只有将其分离后，呈原生质体状态时，才能进行直接的操作与研究。

其分离方法大致可分为两类：渗透压冲击法和机械分离法。渗透压冲击法是指利用低渗溶液促使花粉粒或花粉管尖端破裂，从而释放出精细胞或生殖细胞。机械分离法是指利用机械力量使花粉破损，用以游离出精细胞或生殖细胞。

由于各种植物花粉具有不同的生物学特性，因此为适用于不同的植物，生殖细胞的分离方法有4种（见表4.1）：

（1）一步渗透压冲击法。花粉置于低渗蔗糖溶液中保温一段时间后，花粉自行破裂，生殖细胞随营养细胞质流出，用此法可分离出棉花等植物的生殖细胞。

（2）二步渗透压冲击法。将花粉置于等渗溶液中培养，当大部分花粉萌发时，加入蒸馏水使渗透压骤降，导致花粉管尖端破裂，释放出生殖细胞。

（3）低酶法。将花粉置于低浓度的酶液与低渗蔗糖溶液中保温，促使花粉破裂释放出生殖细胞。

（4）花粉原生质体释放法。首先分离出花粉原生质体，然后用渗透压冲击法或机械法使花粉原生质体破裂，获得生殖细胞。

表4.1　不同生殖细胞分离方法的适用性

精细胞的分离与生殖细胞类似，但也各具特色。被子植物成熟花粉有两种类型：三细胞花粉与二细胞花粉。三细胞花粉的营养细胞中含一对精细胞，而二细胞花粉的营养细胞中仅含一个生殖细胞，精细胞是在花粉管内形成的。因此，精细胞的分离方法因花粉类型而异。

三细胞花粉的精细胞分离主要有两种方法：

（1）渗透压冲击法。将花粉置于含有一定浓度渗透压调节剂的介质中，任其吸水后自行破裂而释放精细胞。优点是花粉壁不太破碎，碎片易于过滤清除但花粉发育时期与生理状态对渗透压冲击效果有很大影响。

（2）研磨法。有些植物花粉抗低渗，不易破裂，此时可选用研磨法。将悬浮于一定介质中的花粉用玻璃匀浆器或其他装置轻轻研磨，使花粉破裂而又不损伤精细胞。优点是操作简便，不过分依赖花粉的成熟度与生理状态。但研磨需要手工技巧，且研磨后花粉壁碎片较难清除。

二细胞花粉的精细胞分离需待花粉萌发出花粉管，生殖细胞已分裂成精细胞，然后从花粉管中分离精细胞。也有两种方法：

（1）花粉离体培养法。花粉在培养基中人工萌发，待形成精细胞后，应用渗透压冲击或研磨使花粉管破裂。但人工萌发的花粉管在精细胞形成上常不同步，由此分离的精细胞群体中不免混杂一些尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。

（2）活体-离体法。这是较适宜的方法。将花粉授于柱头上，切下花柱插入培养基，待众多花粉管中已形成精细胞，花粉管自花柱切口长出，然后用渗透压冲击或酶液促使花粉管尖端破裂。该法分离的精细胞纯度高，且接近受精前的发育状态。

3）胚囊、卵细胞、合子与中央细胞的分离

卵细胞与中央细胞位于胚囊内，胚囊又位于胚珠内，被珠心与珠被包裹，胚珠外方还有子房壁包围。因此，胚囊的分离程序一般先进行人工解剖，除去子房壁，分离出胚珠。然后，由胚珠中设法分离出胚囊。至于卵细胞、合子与中央细胞，或先经胚囊分离阶段，再自胚囊中进一步操作，或由胚珠直接分离。

胚囊的分离一般采用酶法。所用的酶包括纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶、半纤维素酶等。根据不同植物材料选用不同的酶类，其中纤维素酶与果胶酶最为常用。在胚囊分离实验中，将胚珠置于酶液中酶解，使珠被与珠心细胞离散，裸露出胚囊，一般需在酶解的基础上，适当辅以机械处理，如振荡、击打、压片或解剖，以提高分离的效果。在有些情况下还能获得卵细胞等胚囊成员细胞。有时候，在分离胚囊的同时，也可能分离出胚囊成员细胞。它们一般呈原生质体状态。具体分离技术有多种，大致可分为3类（见表4.2）：

（1）酶解法。以酶解为主要手段，辅以其他措施，可以分离出卵细胞、合子与中央细胞等。在上述酶解法分离胚囊的基础上延长酶解时间，降解胚囊壁，可使卵细胞等逸出。

（2）解剖法。此法不经酶解，单独用显微解剖技术，直接从胚珠中分离卵细胞等。这主要在禾本科植物上获得成功，如大麦、玉米等。

（3）酶解-解剖法。胚珠先行酶解，再作显微解剖。该法在不少植物上分离出卵细胞、合子与中央细胞等。

表4.2　不同分离方法的特点