雄性细胞的离体融合

植物雌、雄配子体成功分离为性细胞的离体融合提供了有利的工具。从此，配子间的接触、融合以及受精卵的发育可在人工已知条件下进行，并可对其全部动态过程进行显微追踪观察。

1）融合过程中细胞的动态变化

（1）融合过程中的细胞膜动态。利用膜表面特征探讨诸如配子粘连、识别和融合等问题，这对研究离体受精过程中可能的配子相互作用是至关重要的。对高等植物配子膜表面特征较直接的探索是关于对膜表面糖蛋白及其他凝集素受体的分离与标记。一些实验结果表明，受精会引发卵细胞表面蛋白的重新排布等现象。

不同的体外受精系统中性细胞融合的原理不同，因而膜重组的方式也不尽相同。电融合情况下精、卵细胞膜接触点被电脉冲击穿，精细胞质很快进入卵细胞。显然精细胞膜作为其中的一部分参与了受精卵细胞膜的重组。

图4.5　细胞膜在PEG诱导融合中的动态及融合产物膜重组的方式示意图

PEG和CaCl2诱导的性细胞的融合行为相似。以PEG诱导的融合为例，可将细胞膜在融合中的动态及融合产物膜重组的方式归纳为3类（见图4.5）：①大小相似的两性细胞间的融合，如卵细胞与中央细胞间的融合。两细胞开始先相向压缩成一个圆，此时两细胞间的双层膜仍把两细胞的细胞质隔开。以后膜消失，两细胞合二为一。在这类融合中两细胞的细胞膜都参与形成了融合产物的细胞膜。②大小悬殊的两性细胞间的融合，如烟草生殖细胞与卵细胞、中央细胞与卵细胞间的融合。当紧密粘连的两细胞开始融合时，两细胞在接触点处已贯通，小细胞质进入大细胞，这样大小细胞膜均参与形成融合体的细胞膜。③小细胞（如核质体的细胞）与大细胞的融合，如精细胞与卵细胞或中央细胞的融合。这种情况下小细胞整体进入大细胞，故小细胞膜并不参与融合产物细胞膜的形成。

（2）融合过程中的细胞质动态。分离后的卵细胞、中央细胞除已无外壁外，所观察到的细胞极性、胞质运动状态等细胞学重要特征与分离前基本一致。基于此，便可利用离体受精系统来测试精细胞的粘连和融合对卵细胞胞质动态的影响。

精卵融合触发的一个重要生理变化是卵细胞质内游离钙的瞬间增加。在融合一段时间后，受精卵胞质游离钙才恢复到原初水平。进一步研究发现配子融合激活了细胞膜钙通道，使之开放，引起钙流。这种现象始自精子进入位点附近并向受精卵的其余部分扩散。这一结果表明高等植物受精卵的激活很可能与动物的类似，钙信号传导系统起了至关重要的作用，但这还需在更多物种中加以验证。

受精卵中的胞质重组。在体内自然受精过程中，精细胞质的传递因种而异，从已有证据来看，至少有部分被子植物的精细胞质未能进入卵细胞。而在离体受精时，精细胞质则全部进入卵细胞。这为研究精细胞质在受精卵中的命运、精细胞质对卵细胞质以及对卵细胞激活和发育的影响，两性细胞质间的相互作用及亲和性提供了独特的系统。

在离体受精条件下，雌、雄配子细胞质汇合的时间进程因不同的融合方法、融合组合以及细胞状态而有所不同。在电融合时，由于电脉冲将两配子粘连处的细胞膜击穿，精细胞质随即进入卵细胞中。但汇集一处的两性细胞质并未立刻相容而重组。当精核开始游离入卵细胞质时，周围界限逐渐模糊，直至精核本身被卵细胞质包裹而不易追踪，此时，可认为受精卵细胞质开始重组。胞质重组完成的形态学特征在有大量液泡的性细胞融合时较易掌握。如卵细胞与助细胞在低渗条件下的自发融合，其重组完成的形态学标志是分别来自两个细胞的大液泡合二为一，形成新的中央大液泡。

（3）融合过程中的细胞核动态。正常情况下雌—雄核融合是配子融合后的必然阶段。通过离体受精系统为观察精核进入卵细胞或中央细胞后如何运动到细胞核与之接触并融合提供了便利。

烟草中央细胞容易分离，且因具有大液泡，雄核进入后较易追踪，是较好的观察雄核运动的操作系统。以PEG诱导精子或生殖细胞与中央细胞融合时，可发现雄核有两种运动形式：①雄核进入中央细胞立刻向一侧滚动数微米后停止，几秒后，又突然向前运动。②雄核缓慢地从中央细胞内侧做向心的基本匀速缓慢运动。这两种运动前者快速而不连续，后者连续但缓慢，都与中央细胞内细胞器状颗粒的运动相似。由此推测雄核的运动可能是被动地随胞质流动而动。

核融合的动态。为了进一步了解核融合本身需要多长时间、核融合的方式怎样、核融合的动力学机制如何等一系列核融合的生活动态，在烟草中央细胞离体受精过程中发现：

（i）分离后的中央细胞内各种内含物以多种形式快速运动，显示出旺盛的生活力。在显微镜下连续观察30 min仍可见活跃的胞质运动。说明一定时间的持续显微观察对细胞生活力没有明显影响。

（ii）中央细胞离体受精过程中精核首先与一个极核融合，然后再与另外一个极核融合。

（iii）核融合过程非常快，在室温条件下，仅以秒计。

（iv）整个融合过程与一般细胞的PEG诱导融合过程相似。

（v）在融合过程中始终可见两性核仁，证明烟草中央细胞的受精属于有丝分裂前期。

（vi）人工培养条件下虽与胚囊内自然条件下有较大差异，但从核融合及胞质运动的情况看其细胞内微环境仍相对稳定。融合后的中央细胞仍可进行核的分裂，表明其自然发育规律至少在早期阶段并未因离体操作而有实质性改变。

综上所述，核融合过程与细胞融合过程非常相似，但离体细胞融合是由各种诱导因素介导融合的，对于核融合是由什么介导的，有一种假说认为：首先是由内质网在雌、雄两核间架桥，连接两核的外膜。接着，内质网短缩使两核靠近，并在两核间形成通道使两核融合。

2）影响细胞离体融合的因素

（1）性细胞形态与体积对离体融合的影响。①形态的影响。无论经酶解或直接解剖得到的卵细胞一般无细胞壁，即为原生质体，呈圆球形。而分离的精子虽无壁却有两种状态，呈圆形和蝌蚪形。大多数精子一逸出即变圆，只有少数可较长时间保持尾状结构。据报道，两种形态的精子在与卵细胞的融合过程中显示出了差异。圆形精子与卵细胞粘连后通常停滞一段时间才开始真正细胞融合；而具尾精子一经与卵粘连即很快完成融合，且融合成功率几乎为100%。离体条件下的配子形态受环境溶液的渗透压影响。据报道，在电融合时相对低渗的条件有助于提高融合率。稍低渗时，细胞充分膨胀，保持完美圆形，使得细胞间的接触成为点接触，这是电融合成功的必要条件。②体积的影响。在各种性细胞融合中，精子-中央细胞与生殖细胞-中央细胞的离体融合频率＞精、卵的离体融合频率＞生殖细胞-卵细胞融合频率，这说明造成这一结果不是配子识别作用，而是其他原因。一个最可能的影响因素是融合双方的细胞体积比。孙蒙祥等（1995）经一系列实验证实融合双方体积比对融合起到重要的调节作用。当融合双方体积悬殊且一方足够小时，小原生质体可一跃而入大者，速度快且效率高。但其作用机理尚不明确，可能与某些物理因素如膜表面弧度和表面张力等有关。

（2）精、卵融合的亲和性。自离体受精系统建立以后，人们就提出利用这一技术克服不亲和障碍，进行作物改良的设想，并希望开辟一条途径以填补介于传统有性杂交和体细胞杂交之间的空白，但大多杂交合子却不能存活。这表明卵细胞作为外源基因的天然受体在细胞杂交中确有其优越性，同时，在离体受精条件下进一步证实了远缘杂交在配子融合过程中的不亲和性。受精工程所能克服的应是那些以花粉-柱头或花粉-花柱相互作用为基础的不亲和障碍。