实验九 细胞核与线粒体的分级分离
将亚细胞组分进行分级分离是研究细胞器的化学组成和生理功能，或制备某些生物大分子的基本方法。细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同。常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离。其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析3步。这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
一、实验目的
（1）掌握差速离心技术分离制备动物细胞核及线粒体的方法。
（2）掌握对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定的方法。
二、实验原理
用组织匀浆的方法在悬浮介质中进行差速离心制备线粒体。在一给定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一段时间后，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降的先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和微体、核糖体和大分子等。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器结构和酶的活性，有利于分离。此外，该方法中采用的氯化钙有稳定核膜的作用。整个操作应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B活性染色法。
三、实验用品
（1）材料：小鼠。
（2）器材和仪器：玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、尼龙布（或纱布）、平皿、牙签、冰块。
（3）试剂：0.25mol/L蔗糖－0.003mol/L CaCl2溶液、1%甲苯胺蓝染液、0.02%詹纳斯绿B染液、0.9%NaCl溶液。
四、实验内容
（一）细胞核的分离提取
（1）实验前大鼠空腹12h，颈椎脱臼法处死后迅速剖腹取肝，剪成小块（去除结缔组织），尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中反复洗涤洗净血水，用滤纸吸干。
（2）将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖－0.003mol/L CaCl2溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入，缩短匀浆时间。
（3）剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中。整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
（4）将装有滤液的离心管配平，放入普通离心机，2 500r/min，离心15min，缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体时使用。余下沉淀进行下一步骤。
（5）用6ml的0.25mol/L蔗糖－0.003mol/L CaCl2溶液悬浮沉淀物，2 500r/min离心15min，弃上清液，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片，自然干燥。
（6）将涂片用1%甲苯胺蓝染色后盖片观察，可见深蓝色细胞核。
（二）高速离心分离提取线粒体
（1）将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，17 000r/min离心20min，弃上清液，留沉淀。
（2）加入0.25mol/L蔗糖－0.003mol/L CaCl2液1ml，用吸管吹打成悬液，17 000r/min离心20min。将上清液吸入另一试管中，留沉淀，加入0.1ml的0.25mol/L蔗糖－0.003mol/L CaCl2溶液混匀成悬液（可用牙签）。
（3）取沉淀物悬液，滴在干净载玻片上（注意勿太浓密），不待干即滴加0.02%詹纳斯绿B染液染20min，覆上盖玻片。
（4）镜检：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验注意事项
（1）动物材料实验前可空腹过夜，以降低肝脏组织中的脂肪含量，便于实验操作。
（2）实验中必须注意保持细胞器的完整性，避免过于剧烈的机械操作。尤其是线粒体在保持了呼吸氧化功能时才能经活性染色法检测。
（3）由于线粒体进行活性染色法的检测，所以样品制备好后应尽快染色，不要放置过久。
（4）试验全过程要在0～4℃进行，如果使用非冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织，缩短匀浆时间，保持其生理活性。
六、作业与思考题
（1）将线粒体沉淀做一涂片，用1%甲苯胺蓝染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
（2）分离出的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置室温2h后再染色，比较两者着色的差异。
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