外周血淋巴细胞分离法

实验24　外周血淋巴细胞分离法

(Separation of peripheral blood lymphocytes)

【目的】

了解密度梯度离心法分离淋巴细胞的原理及其操作过程。

【原理】

淋巴细胞分离液是由60％的聚蔗糖2份和34％的泛影葡胺1份混合制成。它具有分子量大、无化学活性、20℃时比重为1.077±0.001的特性。血液中各种细胞的比重不同，淋巴细胞与单核细胞的比重约为1.070，而粒细胞和红细胞的比重为1.092左右。将血液加至分离液上，通过离心，可使一定比重的细胞按相应密度梯度进行分布，从而将淋巴细胞与其他血细胞分离开。

【材料】

1.淋巴细胞分离液(比重1.077±0.001)。

2.肝素。

3.无Ca^2＋、Mg^2＋的Hanks溶液，pH7.2～7.6。

4. RPM I 1640培养液(含10％小牛血清)。

5.其他:注射器、吸管、滴管(均为无菌)、血球计数板，水平离心机、显微镜等。

【方法】

1.无菌抽取静脉血2ml，去掉针头注入含有肝素的无菌试管中并摇匀，加入2ml Hanks溶液进行对倍稀释，混匀。

2.用吸管吸取稀释血液并沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中(血液∶Hanks液∶淋巴细胞分离液的比例为1∶1∶1)，沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面(图24-1)。

图24-1　淋巴细胞分离液分离结果

3.经水平离心机离心(2000r/min×20min)，小心取出试管。

4.用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次1500r/min离心10min。

5.弃上清液，加RPM I 1640培养液1ml混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。

(1)细胞计数:取1滴细胞悬液置血球计数板上，静置片刻，显微镜下计数四角四个大方格内的细胞数，按下列公式计算出细胞总数。

(2)台盼蓝拒染法测定细胞活力:取4份0.2％台盼蓝与1份4.25％生理盐水混合，将台盼蓝生理盐水溶液与细胞悬液等量混合，在3min之内压片，在光学显微镜下计数未染色的细胞(为活细胞)与染色细胞(染成蓝色，为死细胞)，计算活细胞占细胞总数的百分数。

6.最后将淋巴细胞悬液用RPM I 1640培养液配成相应的细胞浓度备用。

【结果】

在回收细胞分离液上界面的总细胞中单核细胞应占90％以上(同时细胞存活率应大于90％)，其中的粒细胞占0～5％，血小板小于0.5％，红细胞占0～7％。

【注意事项】

1.抽血后应在2h内使用。

2.注意将稀释后的血液轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖液面上，避免破坏其界面。

3.在收集单核细胞时，将吸管轻轻插入单核细胞层，沿管壁轻轻旋转吸取细胞。

【思考题】

1.免疫细胞都包括哪些细胞?

2.常用的外周单核细胞的分离与纯化技术有哪些?密度梯度离心法的原理是什么?