肿瘤细胞分离鉴定

体外测定免疫细胞的功能，首先要从外周血或组织中分离所需的细胞。根据细胞的表面标志、理化性质和功能可选择不同的分离方法。

（一）外周血单个核细胞的分离

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验最常用的细胞群，其分离也是分离纯化T、B细胞的首要环节。常用的方法是聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque，F-H）密度梯度离心法。其原理是将聚蔗糖和泛影葡胺按适当的比例混合，配制成密度为1．077的分层液（淋巴细胞分离液），将稀释后的抗凝血叠加在分离液上，离心后外周血中各种血细胞的比重不同使不同密度的细胞呈梯度分布，形成不同的层次和细胞区带，从而分离出PBMC（图19-7）。

图19-7　密度梯度离心法分离PBMC示意图

（二）淋巴细胞及其亚群的分离

淋巴细胞及其亚群的分离有许多方法，如尼龙棉吸附分离法、E花环形成分离法等。由于单克隆抗体的应用及免疫学技术的发展，可通过以下方法进行分离。

1．免疫吸附分离法 应用已知的抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，表达相应细胞表面标志的淋巴细胞被贴附在培养板上，可与悬液中其他细胞分开。

2．免疫磁珠分离法 此法是将特异性抗体（如抗CD3、抗CD19等）交联在磁性微珠表面，加入细胞悬液中，具有相应表面标志的细胞与磁珠上的特异性抗体结合。再将细胞悬液置于磁场中，因磁珠被磁场吸引，而将磁珠结合的细胞与未结合的细胞分开，可获得较高纯度的所需细胞。

3．流式细胞仪分离法 又称荧光激活细胞分离法（fluorescence activated cell sorting，FACS）。流式细胞仪（flow cytometer）集光学、流体力学、电子学和计算机技术于一体，可对细胞进行多参数定量测定和综合分析，这些参数包括细胞大小、核型、表面分子的种类等。基本流程为：先将样品制备成单细胞悬液，与一种或多种荧光素标记抗体反应。细胞悬液经样品孔加入，在高压鞘液的作用下使细胞排成单列经喷嘴喷出形成液滴射流，每一液滴中包裹一个细胞。当液滴射流与高速聚焦的激光束相交，液滴中的细胞受激发光照射，产生散射光并发出各种荧光信号，后者被接收器检测。散射光和荧光信号经计算机收集、处理，进而对细胞特征进行统计和分析。同时，分选部件将所欲分选的细胞液滴充电，带电液滴在分选器的作用下偏向带相反电荷的偏导板，落入适当容器中，达到分选的目的。