细胞分化和干细胞

第二节　细胞分化和干细胞

在个体发育中，细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。细胞分化不仅发生在胚胎发育中，而是在个体一生中都进行着，以补充衰老和死亡的细胞，如多能造血干细胞分化为不同血细胞的细胞分化过程。细胞分化（cell differentiation）是指同一来源的细胞通过细胞分裂产生结构和功能上有稳定性差异的子代细胞的过程。人的受精卵发育成胎儿需经平均41次的有丝分裂，可以产生2⁴¹＝2.2×10¹²个细胞，成人的细胞数达2×10¹⁴。成人细胞达到200多种，这些细胞均来源于一个受精卵细胞。这些细胞最后分化成为机体中各种不同类型的细胞，发挥各自的特殊功能，既包括形态、结构的变化，又有生理功能和生化特性的变化。不同的发育阶段有不同的形态和功能的改变，分化成不同的细胞，细胞一旦分化成一个稳定类型的细胞之后，就不可能逆转。

细胞分化是一种相对稳定而持久的过程，并可将遗传特性传给后代细胞，从而导致个体发育的不可逆性。但在某些特定条件下，使具有增殖分裂能力的细胞处于有利分化逆转的特定环境中。细胞分化又是可逆的，在诱导分化因素的作用下，可使高度分化的细胞通过重新分裂，回复到胚胎细胞状态，这种现象称为去分化（dedifferentiation），又称逆转。此外，一种类型的分化细胞可以转化为另一种类型的分化细胞，称为横向分化或转分化（trans－differentiation）。

细胞分化具有以下几个的主要特征：①细胞间产生稳定性差异；②在细胞形态产生明显差异之前，细胞分化方向即已确定，称为细胞决定（cell determination）；③通常随着细胞分化程度的提高，细胞分裂能力逐渐下降；④细胞分化具有时间性和空间性。

一、胚胎细胞的分化

受精卵是全能细胞（totipotent cell），它发育到三胚层之后的胚胎细胞是一种多能细胞（pluripotent cell），在微环境的作用下可向特定的稳定型分化，外胚层只能分化为神经细胞、角质形成细胞等。在卵裂时由于细胞质分布不均等，可决定早期的细胞分化，这种特殊的卵细胞胞质组分称为细胞质决定子（cytoplasmic determinant）。随着一次次细胞质的不均等的分裂，致使子细胞发生差异。说明细胞分化受细胞质的控制。而实验表明，在完全没有核的情况下，卵裂不会发生，说明细胞核起重要作用。细胞核中的组蛋白对基因表达有抑制作用，而非组蛋白可以解除基因抑制，使一些基因开放。在环境中某些物质可诱导这两种蛋白的结合而调节一些基因的开放或关闭，进而使分化细胞表达不同蛋白，而呈现不同的功能。这又说明细胞核的遗传物质与分化细胞的生物性状密切相关。此外，胚胎细胞的分化受细胞外环境的调节，如一部分细胞对邻近细胞的形态发生产生影响，决定其分化方向称为细胞诱导（cell induction）；对其形态发生产生抑制的又称为细胞抑制（cell inhibition）。

二、成体中的细胞分化

成体中的细胞分化是通过不断更新来进行的，细胞生长发育的过程就是细胞不断分化的过程，主要靠组织中存在的一小部分未分化的干细胞自主进行分裂，再经分化形成子代细胞。干细胞可无限制地分裂，分裂的子代细胞可作为干细胞不断增殖和分化以维持组织特性，或者不可逆地向终末细胞分化直到衰老死亡。

1.造血干细胞的分化　血液中存在各种功能各不相同的细胞，它们分为红细胞和白细胞两大类。白细胞又被分为粒细胞、单核细胞和淋巴细胞3大类。所有血细胞的寿命都很有限，需要在整个生命过程中被不断地更新和补充。人体骨髓和脾脏是造血器官，具有较多的有自我增殖分化能力的多能造血干细胞（hematopoieticstemcell，HS），多能造血干细胞增殖分化产生定向干细胞，定向干细胞再分裂分化产生各种血细胞。定向干细胞的特点是：①已经有所分化，失去多方向分化的能力；②增殖能力有限，只能再分裂数次；③定向干细胞具有对某些调节因子起反应的受体结构。

骨髓是造血的主要器官，富含多能干细胞，在造血因子存在下，在体外进行骨髓细胞培养时能形成细胞集落，称为体外培养的集落形成单位（colony forming unit－culture，CFU－C）。造血干细胞的分化依赖于所处的造血微环境，主要靠骨髓间质细胞分泌的细胞因子和细胞外基质。

骨髓细胞中的多能干细胞可分化成髓系定向干细胞和淋巴定向干细胞。淋巴定向干细胞最终可分化成T细胞、B细胞，而髓系定向干细胞的分化与细胞因子种类和浓度有关：①在含甲基纤维素的体外集落培养时，若加入大剂量EPO可形成1000个以上大型红细胞集落，称为爆式红系集落形成细胞（burst forming unit－erythroid BFU－E）；②若加入小剂量EPO则产生8～50个细胞的小型集落，称为红系集落形成细胞（colony forming unit－E，CFU－E）；③若加入GM－CSF则形成粒细胞巨噬细胞集落形成细胞（CFU－GM）；④若加入TPO则形成巨核细胞集落形成细胞（colony forming unit－megakanyocyte，CFU－Meg）。由此可见，各类血液细胞的形成均受到不同集落刺激因子（CSF）的调节。同时这些集落因子也是维持细胞存活的必要条件，在没有CSF存在的培养情况下，细胞将会凋亡。

2.细胞分化与肿瘤　一般说来，癌变是指细胞增殖和分化的异常，至少某些恶性肿瘤是细胞分化受阻的结果。在细胞分化异常方面，白血病无疑是最典型的例子。如急性早幼粒白血病（APL）患者各器官中早幼粒细胞的集聚提示，这种疾病可能是髓系细胞分化受阻的结果。APL病患者中90%存在着特异染色体易位t（15；17），即第17号染色体上维A酸受体（RARa）基因和第15号染色体早幼粒白血病（PML）基因交互易位，形成PML/RARa融合基因。RAR是一种维A酸受体，作为转录因子，它调节靶基因表达，促进粒细胞分化。在t（15；17）易位中的另一个受累基因为PML，该基因编码的蛋白是一种核基质相关的磷酸化蛋白，它的功能与它在细胞中的定位密切相关。正常细胞中，PML在核中与多种蛋白结合，形成核体的致密结构，通过募集各种重要的核内调节蛋白而影响细胞分化、成熟等基本生理过程。当PML和RAR因染色体易位而发生融合后，融合蛋白中的RARN端部分被PML序列所取代，从而抑制了野生型RAR和PML的正常功能，阻断了粒细胞的分化。

由于肿瘤细胞并没有丧失调控正常生长和分化的基因之表达能力，故癌变有可能逆转。在某些因子的影响下肿瘤细胞会发生分化，向正常细胞方向改变，而使肿瘤细胞恶性逆转。诱导剂主要是诱导肿瘤细胞分化基因重新启动，而使恶性的癌基因受到抑制或灭活，或使膜表面分化受体激活，导致正常基因表达以产生分化表型。近来发现抑癌基因也有诱导肿瘤细胞分化的功能。用于白血病和肝癌细胞的诱导剂有：全反式维A酸（ATRA）、环磷酸腺苷（cAMP）衍生物、联苯双酯（DPB）、氧化赖氨酸（L－4－oxalysine OXL）、羟喜树碱（10－hydroxycamptothecin，HCPT）、抑癌基因及原癌基因的反义寡核苷酸（antisense oligonueleotides）、丹参酮、人参、亚硒酸钠（Na₂SeO₃）、地塞米松等。

三、细胞分化与基因表达

细胞分化是基因选择性表达的结果，由于基因表达的差异，才可能出现形态和功能上不同的细胞。基因表达上的变化，导致组织特异性蛋白的产生，不同细胞在蛋白质组成上的差异导致细胞结构的不同。细胞分化就意味着不同细胞中有不完全一致的基因活化，而表达出某些特异性的功能蛋白。因此，细胞分化的机制就是基因表达调控的机制。细胞分化的调控可以发生在不同的水平：转录前水平（染色质和DNA水平）、转录水平、转录后水平、翻译水平和蛋白质形成后活性调节水平，原则上调控可发生在每个环节。在基因表达的几个层次中，细胞分化主要是在转录水平上的调控，即选择性转录上。

1.细胞分化和基因组关系　现在我们了解的基因组内基因分成两类：①维持细胞生存所必需的结构和功能蛋白质的编码基因，称为管家基因（house keeping gene），它是各类细胞共有的，如细胞分裂和物质能量代谢有关的各种蛋白质编码基因。此外，还包括tRNA，rRNA基因。这类基因的表达一般比较稳定，随细胞分化的变化小，称为组成性表达。②奢侈基因（luxury gene），这类基因为细胞特异性蛋白质的编码基因，对细胞分化起直接的作用，这种基因的表达是在一定的时间空间和在诱导分化的因子作用下进行的，称为基因的选择性表达。从分子层次看，细胞分化主要是奢侈基因中某种（或某些）特定基因选择性表达的结果。某些基因的选择性表达合成了执行特定功能的蛋白质，从而产生特定的分化细胞类型。

目前实验证明，基因的选择性表达主要是在转录水平上调控，其次为转录加工、翻译及其修饰。高等生物真核细胞基因的转录调节序列，在功能上有两类：一是对环境改变的反应，称为诱生性序列；另一类是在特定的组织才发挥作用，称为组织特异性序列。前者如热休克基因、β^－干扰素基因等，后者如Ig基因在特定种类淋巴细胞中特异性表达。

2.基因组合调控　真核细胞转录起始复合物前体（PIC）的装配是转录调控的重要环节，它涉及RNA聚合酶除外的一系列起始因子有顺序的作用以及染色体的构象。高等真核生物体内每一种类型的细胞被认为都有特定的基因调节蛋白的调控，以保证只表达适合于该细胞类型的那些基因。一个基因可以受许多调节蛋白的调控，同样，一种调节蛋白也可以调控许多不同的基因。在这些调节蛋白中，有些为转录激活因子（activators），有些为转录抑制因子（repressors）。

转录调节蛋白通过一定的组合，形成一系列的调节模块，依次结合到被调节的基因序列上，在正确的时间和空间，表达正确的基因，这就是组合调控（combinational control）。这种组合调控可以使为数不多的基因调节蛋白，调控众多细胞类型的形成。

3.基因的次序表达和表达模式的维持　细胞分化应该是基因按一定规律表达的结果，这种在个体发育进程中不同的基因按一定的时空顺序被激活的现象，称为基因的次序表达。例如，在肌细胞的发育过程中，肌原蛋白MyoD和Myf5首先表达，然后激活MRF4的表达，MRF4的表达进一步诱导了肌细胞生成素（myogenin）的表达，最后达到了肌细胞的分化成熟（图1－12）。

而细胞基因活性状态的维持还依赖调控因子的连续存在，如图1－13所示，转录因子A的表达可以正反馈调节自身表达，该细胞一直含有A蛋白。转录因子A还可以抑制B基因的表达，而激活C基因的表达。细胞分裂后，因为子细胞中含有足够的A因子，使基因B和C的表达模式得以保留，说明基因调节模式是可以遗传的。基因调节模式的遗传让细胞对其发育的历史有了一个记忆。

图1－12　基因的次序表达

图1－13　细胞基因活性状态的维持

4.染色体修饰　前面提到基因活性状态的维持和传递决定于形成转录复合物的调控蛋白，而转录复合物与DNA的结合则受到染色质结构的影响。人的基因组DNA为3.2×10⁹bp，DNA和蛋白质组成染色质，染色质的基本结构单位是核小体，由146bp DNA环绕组蛋白八聚体7/4圈，构成核心，加上54bp连接DNA和H1组蛋白。由此构成念珠状的染色质丝，6个核小体为一圈进一步构成螺旋管，由螺旋管再形成超螺旋管，最后形成中期染色质。把DNA的长度压缩了5000～10000倍，这种遗传物质载体结构有利于多细胞生物的生命活动的调节控制。

转录起始复合物能否顺利结合到特异基因的启动子，进而进行基因转录，受到DNA结构的影响。高等生物通过DNA甲基化和组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化、生物素化、ADP－核苷化等，以及其他染色体构型重塑的方式来调控基因的表达，称为表观遗传调控（epigenetic regulation）。

雌性哺乳动物X染色体的失活，就是通过DNA甲基化来实现的，甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化（图1－14），甲基化引起的X染色体的基因失活只有在生殖细胞形成时才重新恢复活性状态。

图1－14　DNA甲基化的细胞遗传

四、干细胞

干细胞（stem cell，SC）是一类具有自我更新（self－renewing）能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可分化成多种功能细胞。根据干细胞的分化能力，可以分为全能干细胞（totipotent cells）、多能干细胞（multipotent stem cell）和单能干细胞（unipotent stem cell）。全能干细胞可以分化为机体内的任何一种细胞，直至形成一个复杂的有机体。多能干细胞可以分化为多种类型的细胞，如造血干细胞可以分化为12种血细胞。有些文献中将分化潜能更广的细胞称为多潜能干细胞（pluripotent stem cell），如骨髓间充质干细胞，而把向某一组织类型细胞分化的干细胞称为多能干细胞，如前面提到的造血干细胞。单能干细胞只能分化为一种类型的细胞，而且自我更新能力有限（图1－15）。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞又可分为胚胎干细胞和成体干细胞。

图1－15　干细胞的分化潜能

1.胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）　是指从胚胎内细胞团或原始生殖细胞筛选分离出的具有分化为机体所有细胞潜能的全能性细胞。ES细胞能表达POU家族的转录因子Oct－4，具有较高的端粒酶活性。

哺乳动物ES细胞来源于囊胚期的多能内细胞团。在适合条件下，ES细胞可以在体外长期培养并一直保持未分化状态。如在白血病抑制因子（LIF）的存在下，或饲养层细胞（如成纤维细胞）存在下较容易保持未分化状态。去除饲养层或LIF等分化抑制因子进行悬浮培养时，ES细胞倾向于自发分化形成拟胚体（EB），将拟胚体进行贴壁培养往往可同时或先后出现多种类型的分化细胞。在拟胚体中可检测到神经干细胞标记基因nestin的表达。拟胚体在含bFGF和laminin的N2培养基中继续培养扩增为神经前体细胞，去除bFGF后可最终诱导分化为神经细胞。另一方面，nestin阳性细胞在含B27补充剂、bFGF的N2培养基中增殖为胰腺前体细胞，再进一步诱导为类胰岛细胞。在其他不同的诱导剂作用下，ES细胞可向不同方向分化，成为造血细胞、肌肉细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。

ES细胞的用途主要有：①克隆动物，由体细胞作为核供体进行克隆动物生产，虽然易于取材，但克隆动物个体中表现出严重的生理或免疫缺陷，而且多为致命性的；②转基因动物，以ES细胞作为载体，可大大加快转基因动物生产的速度，提高成功率；③组织工程，人工诱导ES细胞定向分化，培育出特定的组织和器官，用于医学治疗的目的。

2.成体干细胞　在人的一生中，皮肤、小肠和血液等组织需要不断地更新，这个任务是由成体干细胞完成的。成体干细胞（adult stem cell）又称为组织干细胞（tissue stem cell），是指一类具有分裂和分化能力的细胞。其中，多能干细胞可以分化出多种类型的细胞，但它不可能分化出足以构成完整个体的所有细胞，单能干细胞来源于多能干细胞，具有向特定细胞系分化的能力，也称为祖细胞或前体细胞（progenitor）。

成体干细胞具有以下生物学特点：①终身保持未分化或低分化特征；②在机体的中的数目、位置相对恒定；③具有自我更新能力；④分裂增殖能力强；⑤具有多向分化潜能，能分化成不同类型的组织细胞，如造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞等成体干细胞具有一定的跨系，甚至跨胚层分化的潜能；⑥分裂的慢周期性，绝大多数干细胞处于G0期；⑦通过两种方式分裂，对称分裂和不对称分裂。前者形成两个相同的干细胞，后者形成一个干细胞和一个祖细胞。

成体干细胞有骨髓间质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、脂肪干细胞、角膜干细胞等（图1－16）。干细胞技术是一个飞速发展的领域，涉及细胞生物学、遗传学和临床医学等多门学科，有望成为治疗多种恶性疾病的新手段。干细胞的使用是组织工程领域的重要突破，由干细胞构建的组织中干细胞通过定向分化源源不断地产生组织特定的细胞，可在体内长期发挥作用。如果这些干细胞经过遗传改造或体细胞核移植而获得的，则克服了器官供应有限和组织排斥的问题，而且由干细胞介导的组织移植其自我修复能力远超出传统的组织移植。此外，利用干细胞及其分化细胞对受损细胞进行替代治疗，是干细胞在临床上的重要应用。最常见也是最成功的干细胞治疗是临床上广泛使用的造血干细胞移植。

图1－16　成体干细胞的可塑性