真核细胞基因组的分离与纯化

第一节　真核细胞基因组DNA的分离与纯化

DNA主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多，并且以核蛋白体形式存在于细胞中。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是去除体系中的其他成分，如蛋白质、多糖、脂类及其他不需要的核酸（RNA）等生物大分子的过程。

一、裂解

细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切片等方法。为了获得大量完整的DNA，一般采用裂解液等温和的方法破碎细胞。

裂解液一般都含有去污剂（如SDS、Triton X－100、NP－40、Tween 20等）和盐（如Tris、EDTA、NaCl等）。去污剂的作用是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的作用，一方面提供一个合适的裂解环境（如Tris）；另一方面可抑制核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸结构的稳定（如NaCl）。裂解体系中还可以加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。

二、纯化

根据DNA本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。

三、DNA提取的实验步骤

（一）材料与设备

1．试剂：消化液（100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris－HCl，pH8．0，25mmol/L EDTA，0．5%SDS，0．1mg/ml蛋白酶K）；pH8．0，25mmol/L EDTA；PBS；TES饱和酚；氯仿；异戊醇；95%乙醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0．1%SDS；1μg/ml RNA酶。

2．仪器：培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管、刻度吸管、加样器、枪头、离心机、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱。

（二）主要步骤

1．如果材料为组织块，可将组织块（200～1 000mg）剪碎后，置入液氮中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎，每100mg组织加入1．2ml消化液（100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris－HCl，pH 8．0，25mmol/L EDTA，0．5%SDS，0．1mg/ml蛋白酶K）。

2．如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g×5min离心；如果材料是贴壁细胞，弃上清液后，胰酶消化收集细胞，500g×5min离心。随后用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞，500g×5min离心，弃上清液，重复一次，并用一倍体积的消化液重悬细胞。

3．组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，50℃消化12～18h。

4．冷却至4℃，加等体积15mol/L TES饱和酚。

5．轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。

6．4℃5 000～8 000r/min离心15～20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白质层。

7．用吸管小心吸取上层黏稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白质层。

8．DNA溶液再加等体积15mol/L TES饱和酚抽提一次，按步骤6、7离心并吸至另一离心管。

9．加等体积氯仿/异戊醇按步骤5、6抽提，离心5min。

10．吸出DNA溶液后，再按步骤9抽提一次。

11．用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。

12．加2．5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。

13．用75%冷乙醇清洗3～4次。

14．室温干燥或冷冻干燥DNA。

15．加适量TE溶液溶解DNA。

四、结果鉴定

1．紫外分光光度计检测：可检测DNA的纯度和含量。一般而言核酸在260nm时吸光度最大，而蛋白质在280nm时吸光度最大。取2μl DNA溶解液，适量稀释，紫外分光光度计测定260nm、280nm吸光度（A）值，计算A₂₆₀/A₂₈₀比值，比值在1．7～2．0∶1之间，说明DNA纯度可。在260nm处，1A双链DNA的浓度为50μg/ml，据此可计算DNA的浓度（μg/ml）＝50×（A₂₆₀）×稀释倍数。

2．电泳检测：可检测核酸的完整性和大小。取2μl DNA溶解液与适量上样缓冲液混合后，经1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察，拍照；如果观察到一条清晰的电泳带，无明显的拖尾，说明DNA完整性好。