不连续密度梯度沉淀法分离与纯化细胞

实验二　Percoll不连续密度梯度沉淀法分离与纯化NK细胞

实验目的

了解Percoll不连续密度梯度沉淀法分离、纯化NK细胞的原理和方法。

实验原理

Percoll是一种包有聚乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒胶体，其渗透压很低（小于20mosm/Kg H₂O），黏度也很小，其密度可高达1．3g/mL，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力（200～1　000g）于数分钟至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此该方法广泛应用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，此外，运用该方法还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

实验材料

（1）Percoll分离液；

（2）RPMI－1640培养液；

（3）小牛血清；

（4）8．5%NaCl或1．5mol/L PBS；

（5）其他：注射器、吸管、滴管（均为无菌），血球计数板，水平离心机，显微镜等。

实验方法

（1）用Ficoll－Hypaque密度梯度离心法分离外周血PBMC。

（2）不同浓度（密度）Percoll溶液的制备：先用9份Percoll与1份8．5%NaCl或1．5 mol/L PBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0．85%NaCl或0．15mol/L PBS）稀释到所需浓度，见表5－1。

表5－1　Percoll分离液浓度与比重的对应表

（3）不连续密度梯度Percoll层的制备：取10mL试管1支，先将试管壁用小牛血清润湿，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳地沿管壁流下，以形成满意的界面。在制备过程中一般可用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然缓慢流下。

（4）装样：按顺序向试管中由下向上逐层叠加50%、47．5%、45%、42．5%和40%五种不同密度的Percoll分离液，每层加Percoll分离液1．5mL。从外周血中分离的PBMC细胞1×10⁷悬于不含血清的RPMI－1640培养液中，取1．5mL缓慢加至最上层的Percoll分离液液面上。

（5）离心：2000r/min离心30min。

（6）取样：收获的含有Percoll液的细胞用Hanks液洗涤2次，每次1 000r/min离心10min。

实验结果

一般NK细胞位于42．5%与45%Percoll界面以及该上下两层的Percoll液面之间。

注意事项

（1）样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收；

（2）Percoll分离液本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂；

（3）当所要分离的细胞绝大部分在两层界面之间时，可逐层去除Percoll分离液后收集两层界面之间的细胞，有时大部分细胞位于某一层Percoll分离液中，则需要逐层收集。

（4）由于多层Percoll分离液之间的密度差别不大，因此离心过程中的加速、降速要慢，要平稳。

思考题

如何在Percoll不连续密度梯度沉淀法分离、纯化NK细胞过程中尽量保持NK细胞的活性？