叶绿体色素的提取分离及理化性质观察

实验实训四　叶绿体色素的提取分离及理化性质观察

一、实训目标

（1）学会叶绿体色素提取和分离的方法。

（2）了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。

二、实训原理

叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。

提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。

叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被H＋所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

三、实训材料、试剂与仪器

1．材料

新鲜的植物叶片。

2．试剂

95%（mL/mL）乙醇、石英砂、碳酸钙粉、推动剂（按石油醚、丙酮、苯体积比10∶2∶1配制）、醋酸铜粉末、5%（g/mL）盐酸、甲醇、KOH。

3．仪器

研钵、漏斗；100mL三角瓶、玻璃棒、剪刀、滴管、培养皿、定性滤纸条（5cm×1．5 cm）、毛细管、试管、试管架；石棉网、烧杯（100mL）、酒精灯、铁三脚架、刻度吸量管（2 mL、5mL各1支）。

四、操作要点

1．叶绿体色素的提取

（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。

（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2～3mL 95%（mL/mL）乙醇，研磨至糊状，再加10mL 95%（mL/mL）乙醇，暗处放置3～5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10mL 95%（mL/mL）乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。

2．叶绿体色素的分离

（1）取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将它剪成长约10cm、宽约1cm的滤纸条。

（2）用毛细管吸取色素提取液。在滤纸条的一端（约距这一端的1cm处）画出一条滤液细线，等滤液干燥后，再重复画4～5次。

（3）将滤纸条的另一端（约距这一端1cm处）折成V形，并将它挂在放有层析液的烧杯壁上（注意：色素线要略高于层析液面，且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁），盖上培养皿。

3．叶绿体色素的性质鉴定

（1）荧光现象的观察　取1支20mL刻度试管，加入5mL叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察，溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。

（2）皂化作用（绿色素与黄色素的分离）　在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1．5mL 20%（g/mL）KOH－甲醇溶液，充分摇匀。片刻后，加入5mL苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1～1．5mL蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。

（3）H＋和Cu^2＋对叶绿素分子中Mg^2＋的取代作用　取上述色素乙醇提取液少许于试管中，加入5%的盐酸数滴，摇匀，直至溶液出现褐绿色，当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察、记载溶液颜色变化情况。

4．注意事项

（1）为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行。

（2）研磨时间尽可能短些，以不超过2min为宜。

（3）在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液混浊，且不分层。可激烈摇匀，放在30～40℃的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。

五、问题与讨论

（1）研磨提取叶绿素时加入CaCO₃有什么作用？

（2）叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素在滤纸上的分离速度不一样，这与它们的相对分子质量有关吗？