手性色谱分离原理

1.概述

自20世纪80年代起，随着大量商品化HPLC手性固定相的问世以及对手性识别机理的深入认识，HPLC已经迅速地广泛应用于药物对映体的分离和测定。20世纪90年代以来，随着质谱的迅速发展，液相色谱与质谱的联用技术已经成为手性药物分析最有力的技术之一。

手性HPLC法分为间接法和直接法两种。间接法又称为手性衍生化试剂(chiral derivatization reagent，CDR)法。直接法可分为手性固定相(chiral solid phase，CSP)法和手性流动相(chiralmobile phase，CMP)法。CDR法是在对映体混合物分离前，将其先与高光学纯度的衍生化试剂反应形成非对映体，然后以常规的固定相分离。直接法是直接引入“手性识别”或“手性环境”至色谱系统中，以形成暂时非对映体复合物，从而使对映体混合物分离。

2.手性固定相法

连接在固定相上的手性识别剂，与药物对映体反应形成非对映体复合物，然后进行分离测定的方法叫CSP法，分离的程度和洗脱顺序取决于复合物的相对强度。一种理想的手性固定相(CSP)应能准确、快速测定对映体纯度;尽可能适应多种结构类型的对映体分离;对一系列结构类似的手性化合物，其D、L或R、S对映体洗脱顺序不变，可提供绝对构型信息;应有较高的对映体分离选择性和柱容量，具有制备分离能力。当然，这是人们最期望的CSP，但目前还没有一种CSP能够满足上述的全部要求。根据手性固定相和溶剂的相互作用机制，IrvingWainer提出了手性色谱柱的分类体系:

第1类:通过氢键、π－π作用、偶极－偶极作用形成复合物。

第2类:既有类型1中的相互作用，又存在包埋复合物。最典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱。

第3类:基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。最典型的是环糊精型手性柱，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物形成的手性色谱柱也属于此类。

第4类:基于形成非对映体的金属络合物，也称为手性配位交换色谱(CLEC)。

第5类:蛋白质型手性色谱柱。手性分离是基于疏水相互作用和极性相互作用实现的。但由于市场上可选择的手性色谱柱越来越多，此分类系统有时很难将一些手性柱归纳进去。因此参考Irving Wainer的分类方法，根据固定相的化学结构，将手性色谱柱分为以下几种:刷型或Pirkle型手性固定相、手性聚合物固定相(包括纤维素和多糖衍生物手性固定相、合成手性聚合物固定相)、配基交换手性固定相、环糊精型手性固定相、冠醚型手性固定相、大环抗生素型手性固定相、蛋白质型手性固定相以及分子印迹聚合物手性固定相。

(1)刷型(brush)手性色谱柱是根据三点识别模式设计的，属于Irving Wainer分类中的第一种类型。该类固定相一般是通过一定长度的间隔臂将单分子层的手性有机分子通过适宜的连接基团键合到硅胶载体上而制得，因形似刷子而得名。刷型手性固定相分为π电子接受型、π电子提供型以及混合型三类。最常见的π电子接受型固定相是由(R)－N－3，5－二硝基苯甲酰苯基甘氨酸键合到γ－氨丙基硅胶上的制成，此类刷型手性色谱柱可以分离许多可提供π电子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等对化合物进行衍生化后进行手性分离。π电子供给型固定相常见的是共价结合到硅胶上的萘基氨基酸衍生物，这种固定相要求被分析物具有π电子接受基团，例如二硝基苯甲酰基。醇类、羧酸类、胺类等，可以用氯化二硝基苯甲酰、异腈酸盐、或二硝基苯胺等进行衍生化后，用π电子供给型固定相达到手性分离。近来，刷型固定相出现了π电子供给和接受基团的混合固定相，如WHELK－O和BLAMO及α－BURKE－Ⅱ固定相。α－BURKE－Ⅱ相十分适用于β－阻断剂的手性分离。典型的流动相为二氯甲烷－乙醇－甲醇混合物，比例为85 10 5。加入10 mM醋酸铵可以调整保留时间。

刷型固定相的优势在于其易于合成，另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的选择因子;其柱子载量高，已有多种商品化柱子。它的不足之处在于它仅对芳香族化合物有效，有时不得不进行衍生化反应。

(2)手性聚合物(chiral polymers)固定相，包括纤维素(cellulose)和多糖衍生物(polysaccharide derivatives)手性固定相、合成手性聚合物(synthetic chiral polymers)固定相，常用的是纤维素型手性固定相。

纤维素型手性色谱柱的分离作用包括相互吸引的作用及形成包埋复合物。它们属于IrvingWainer分类中的第2种类型。市售的手性色谱柱为微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸盐纤维素固定相。很多化合物可通过此类型的色谱柱得到分离。这种类型的手性色谱柱种类也很齐全。流动相使用低极性溶剂，典型的流动相为乙醇－己烷混合物。但特别要注意由于氯可以使纤维素从硅胶上脱落，因此要确保流动相中无含氯溶剂。

纤维素固定相的每个单元都为螺旋型，而且这种螺旋结构还存在极性作用、π－π作用及形成包埋复合物等手性分离因素。淀粉代替纤维素制成的此类手性柱显示了和纤维素柱不同的选择性，但是稳定性较差。因为淀粉是水溶性的，因此流动相中必须绝对无水才能保证柱子寿命。手性聚合物固定相商品柱主要是日本Daicell公司制造的chiralcel柱。其中chiralcel OD和chiralcel AD柱几乎可以满足常见的85%的手性化合物的拆分，应用广泛。此类柱子通常用于正相系统，用正己烷－乙醇，正己烷－异丙醇混合溶剂为流动相。Chiralcel OD柱也可用于反相的情况，但流动相必须含有高浓度的高氯酸盐缓冲液，以防止固定相溶解。即使这样，使用较长时间以后色谱柱也难免要受到损害，但是在某些情况下使用反相系统分离效果要优于使用正相系统。手性聚合物固定相chiralcel柱的类型和应用如表9－1。

表9－1　手性聚合物固定相chiralcel柱的类型和应用

这类手性固定相的优点主要是葡萄糖单元的羟基易被取代和官能团化，且该类CSP的载样量大，在大规模制备及色谱应用上有较大的潜力。

(3)环糊精(cyclodextrin，CD)是通过Bacillus Macerans淀粉酶或环糊精糖基转移酶水解淀粉得到的环型低聚糖。通过控制环糊精转移酶的水解反应条件可得到不同尺寸的环糊精。市售的环糊精主要是α、β、γ三种类型，分别含6、7、8个吡喃葡萄糖单元。环糊精分子成锥筒型，构成一个洞穴，洞穴的孔径由构成环糊精的吡喃葡萄糖的数目决定，其手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂肪烃类侧链的包容作用，以及环外壳上的羟基与药物对映体分子发生的氢键作用。γ－环糊精键合固定相适合相对分子量小于200 Da的药物对映体分析，而β－环糊精手性键合固定相相对形成包含物有适宜大小的内腔，适用于较多药物对映体的拆分，因此被广泛使用。

对环糊精的修饰使环糊精型手性色谱柱可以分离更多的化合物，并可用于气相手性色谱分离。衍生化是通过将不同的基团键合到环糊精洞穴表面的羟基上。衍生化反应包括乙基化、S－羟基丙基化、生成S或R－萘基乙基氨基甲酸盐、3，5二甲基苯基氨基甲酸盐和环状对甲苯酰酯。这些新型的环糊精固定相有许多优点，它们可以分离更多化合物，价格上也有竞争力，且由于改进了手性识别能力使其更适用于制备色谱。

(4)手性配基交换(ligand exchange)色谱柱由Davankov发明，它通过一个金属离子结合一个配体分子和一个对映体溶质分子，形成可逆的非对映体复合物，从而达到对映体分离的目的，属于IrvingWainer分类中的第4类手性固定相，主要用于分离氨基酸类。由于此类固定相大多是由手性氨基酸－铜离子络合物键合到硅胶或聚合物上形成，因此流动相中必须含有铜离子以保证手性固定相上的铜离子不至流失。其他的过渡金属元素也已用于手性配基交换色谱，如Ni(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)和Hg(Ⅱ)等，但目前铜离子应用最广。形成络合物的过程十分缓慢，因此有时需提高柱温，最佳温度约50℃。手性配基交换色谱仅对α－氨基酸和其类似物有效，β－氨基酸很难用手性配基交换色谱得以分离。手性配位交换色谱可用于制备，由于流动相中存在铜离子，虽然铜离子能用离子交换柱除去，但增加了样品处理的困难。常用的商品配基交换柱有chiralpak WH和WM等。

(5)大环抗生素型(macrocyclic antibiotics)手性色谱柱是最近发展起来的，通过将大环抗生素键合到硅胶上制成的新型手性色谱柱。此类色谱柱常用的大环抗生素主要由三种:利福霉素(rifamycin)、万古霉素(vancomycin)和替考拉宁(ticoplanin)。利福霉素作为手性添加剂在毛细管电泳分离手性化合物方面得到了成功运用。万古霉素和替考拉宁分子结构中存在“杯”状结构区和糖“平面”结构区。此类色谱柱性质稳定，可用于多种分离模式。手性分离基于氢键、π－π作用、形成包合物、离子作用和肽键等。

(6)蛋白质型(protein)手性色谱柱属于Irving Wainer分类中的第5种类型。分离依赖于疏水相互作用和极性相互作用。目前已有多种蛋白质用于此类手性色谱柱，使用较多的是α－酸性糖蛋白(α－acid glycoprotein，AGP)、人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和卵类黏蛋白(ovomucoid，OV)。该类色谱柱通常可按反相方式操作，流动相的pH、离子强度、有机改性剂的极性和浓度、温度对于对映体的保留时间和立体选择性均有较大影响。蛋白手性色谱柱的载样量均较小，影响了蛋白手性色谱柱在制备色谱中的应用。

(7)冠醚(crown ethers)型手性固定相

冠醚是具有一定大小空腔的大环聚醚化合物，呈皇冠状结构，环的外沿是亲脂性乙撑基，环的内沿是富电子的杂原子，如氧、氮、硫等。用手性冠醚作固定相分离手性化合物的主要依据是不同溶质分子与手性冠醚环腔形成的主客体络合物稳定常数不同。该类固定相主要用于分离一级胺，一级胺必须质子化方能达到分离，因此必须使用酸性流动相，如高氯酸。最常用的是冠醚型固定相是18－冠－6，已有商品化产品，由Daicel公司制造，如Crownpak CR(+)或CR(－)柱。无论左旋体还是右旋体均可达到有效分离，并可通过变化分析物旋光类型而改变分析物出峰顺序。冠醚作为添加剂也用于核磁共振和电泳，但由于其毒性较大，有致癌性，使其应用受到限制。

(8)分子印迹聚合物(molecularly imprited polymers，MIPs)手性固定相

分子印迹技术将材料化学、高分子化学、生物化学、化学工程等学科有机结合在一起，是一种为获得在空间结构和结合位点上与某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术。通过以下过程来实现:①首先以具有适当功能基的功能单体与模板分子结合形成单体－模板分子复合物;②选择适当的交联剂将功能单体交联起来形成共聚合物，使功能单体上的功能基在空间排列和空间定向上固定下来;③通过一定的方法把模板分子脱去。这样就在高分子共聚物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配，并含有与模板分子专一结合的功能基的三维空腔。这个三维空腔可以选择性地重新与模板分子结合，即对模板分子具有专一性识别功能。目前，新兴的分子印迹色谱技术作为分子印迹学的独立分支，在物质的手性分离领域显示出良好的应用前景，将MIPs作为色谱固定相已被成功应用于高效液相色谱、薄层液相色谱及毛细管电色谱中。

手性固定相法有许多优点:①能广泛适用于各类化合物，适用于常规及生物样品的分析测定;②无需高光学纯度试剂;③因无需衍生化反应，样品处理步骤简单;④制备分离方便，定量分析的可靠性高。其缺点是:①样品有时也须进行柱前衍生化法反应;②对样品的结构有一定的限制，其适用性尚不及普通HPLC固定相那样广泛;③迄今为止，CSP商品柱已有几十种，但价格大多昂贵。

3.手性流动相添加剂法

向流动相中加入一手性试剂，它与溶质常以氢键、离子键或金属离子的配位键生成非对映体缔合物，然后以常规HPLC固定相分离的方法叫手性流动相添加剂(CMPA)法。

CMPA法的机理目前认为有两种，一是流动相中手性试剂与对映体形成非对映体配合物，在固定相中的保留和分配不同而得到分离;二是手性试剂吸附在色谱柱上形成动态修饰的手性固定相，对映异构体与之作用不同而得到拆分。与其他手性HPLC法相比，CMPA法有以下优点:操作简便;可使用常规色谱柱;分析过程中较少发生外消旋化;添加剂种类较多，选择范围宽;可在柱后收集到光学纯的异构体单体等。该方法也存在一些缺点，如系统平衡时间长、手性添加剂消耗大、拆分制备时需要除去手性添加剂等。

按照与对映体的不同作用机制来划分，CMPA可分为手性包合试剂、手性亲和试剂、手性离子对试剂、手性配体交换试剂和手性氢键作用试剂等。

(1)手性离子对试剂法是在HPLC流动相中加入反离子，使之与流动相中对映体生成非对映的离子对复合物，由于这些离子对复合物具有不同的稳定性和分配性质，在于固定相发生静电、疏水或氢键作用后，产生差速迁移而得以分离。该法可以用于拆分氨基酸类、β－受体阻滞剂、羧酸及磺酸类化合物。

(2)手性配体交换试剂法是将手性金属配体交换剂加入HPLC流动相中，形成三元非对映体配合物，此配合物与固定相发生立体选择性吸引或排斥反应，由于其结构稳定性和能量的差异，使对映体得以分离。常用的手性配体交换剂为氨基酸及其衍生物与金属离子(Cu、Ni、Cd、Zn等)的配合物，可用于拆分氨基酸及其衍生物、β－受体阻滞剂等。

(3)手性亲和试剂法是基于具有天然手性性质的蛋白质和胆酸盐可用作HPLC手性流动相法拆分对映体添加剂的原理，通过疏水性、静电、氢键和电荷转移等形成非对映体而进行拆分。该法可拆分氨基酸、羧酸、胺类、巴比妥及β－受体阻滞剂等，蛋白质类手性添加剂还可用于药物－蛋白结合率的测定。

(4)手性包合试剂主要有环糊精、环糊精衍生物和手性冠醚。环糊精是一类环状低聚糖同系物由6～8个葡萄糖分子经α－1，4键合生成环状分子，空腔内部由于含有CH和糖苷结合的氧原子而呈疏水性。D－吡喃型葡萄糖2，3位上的羟基在空腔的开口部，而6位上的羟基则位于另一开口部，因此环糊精对疏水性和亲水性药物对映体都具有很强的包含作用，并使包含物的理化性质发生改变。对映体分子进入环糊精手性空腔后即发生主－客反应(如氢键反应、疏水性等)而被拆分。该类添加剂已用于分离氨基酸及其衍生物、巴比妥类、氯胺酮、苯妥英代谢物、美芬妥英及其代谢物、伪麻黄碱、去甲羟基安定以及哌嗪类镇痛药等多种药物的对映体分离。

(5)手性氢键作用试剂，药物对映体通过与其多羰基化合物的分子间氢键作用形成非对映异构体而被拆分，如N－乙酰基－L－缬氨酸－四丁酰胺。该类添加剂可用于拆分氨基酸及其衍生物和巴比妥类药物等。

4.手性衍生化试剂法

首先将对映体经手性试剂衍生，生非对映异构体后，利用常规HPLC方法分离测定的手性拆分方法称为手性衍生化试剂(CDR)法。某些药物在色谱柱上呈现很弱的色谱性质，不宜直接分离，经衍生化转化为酰胺后可显著增强其色谱信号;有些物质需要添加某些基团，以增加色谱系统的对映异构体选择性;或是为了提高紫外或荧光检测的效果等，均可选择CDR法。

为了达到有效分离和准确测定对映体的目的，CDR及其衍生化反应需要满足以下几个条件:手性试剂和反应产物有很好的化学稳定性，手性试剂为光学纯其存储过程中不发生改变;手性试剂和反应产物在衍生化和色谱条件下应是稳定的，反应条件温和、简单，衍生化反应定量(90%～100%)完成;衍生化反应生成的非对映体对在色谱分离时能显示较高柱效;手性试剂应具有对UV或荧光敏感的结构基团;手性化合物对映体的化学结构中应具有易于衍生化的基团，如氨基、羧基等。

常见的CDR的种类及适用范围如下:

(1)酰化试剂:主要用于分离醇类和胺类，常用的有酰胺、酸酐和酰氯等，其反应性顺序为酰氯＞酸酐＞酰胺。反应溶剂常采用苯、甲苯和二氯甲烷等。

(2)异(硫)氰酸酯类:也主要用于分离醇类和胺类，常用的异氰酸酯有苯乙基异氰酸酯(PEIC)、萘乙基异氰酸酯(NEIC)和脱氢枞酸基异氰酸酯等，反应溶剂常采用二氯甲烷、甲苯和氯仿等。异硫氰酸酯常用的有2，3，4，6－四－O－乙酰基－β－D－吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)和2，3，4－三－O－乙酰基－α－D－吡喃阿拉伯糖异硫氰酸酯(AITC)，通常在三乙胺存在条件下，于乙腈、二氯甲烷和二甲基甲酰胺溶剂中反应。

(3)胺类试剂:主要用于羧酸类、N－保护氨基酸、醇类药物和芳基丙酸类非甾体抗炎药、烃基丙三醇、类萜酸等手性药物的衍生化。手性胺试剂一般都具有苯环、萘或蒽结构，提高检测灵敏度。

(4)氯甲酸酯类:主要用于分类羟基醇、胺和氨基酸等，常用试剂包括氯甲酸薄荷醇酯和1－(9－芴基)－乙基氯甲酸酯(FLEC)等。不同的手性药物所需的反应条件和溶剂均不相同。

(5)邻苯二甲醛(OPA)和手性硫醇:主要用于分离氨基酸、氨基醇、胺和硫醇。这类试剂由OPA和各种手性硫醇，如N－乙酰基－L－半胱氨酸、叔丁氧基－L－半胱氨酸和N－乙酰基－D－青霉胺等组成。OPA在硫醇存在条件下，可将胺类衍生化成异吲哚类，此类衍生物通常都具有强烈的荧光和良好的分离度。

除以上几种CDR外，还有光学活性氨基酸类手性衍生化试剂，以苯并恶唑、苯并呋喃为母体的手性衍生化试剂和含萘二甲酰胺以及三氟甲基磺酸酯结构的手性衍生化试剂等。此外，也可以按照药物的化学结构选择CDR:

(1)胺类药物的衍生化反应:许多重要的生化物质如胺、氨基酸和药物的结构中都含有氨基，氨基能够与多种CDR反应，生成酰胺、氨基甲酸酯、脲和硫脲类非对映异构体。能与胺类药物进行衍生化反应的CDR有:酰氯、氯甲酸酯类、异氰酸酯类、异硫氰酸酯类、邻苯二甲醛、酒石酸酐、N－琥珀酰亚胺酯类等。

(2)羧酸类药物的衍生化反应:主要通过形成酯键和酰胺键来完成，目前拆分羧酸类对映体较常用的衍生化试剂是伯胺和仲胺类化合物，一般需要在二环己基碳二亚胺(DCC)和1，1－羟基二咪唑(CDI)等缩合剂、N，N－二烃基碳二亚胺等催化剂的作用下进行。

(3)羟基类药物的衍生化反应:羟基类药物主要有醇类和酚类。羟基的衍生化反应有与酸或酰氯的酯化、与氯甲酸酯的碳酸化和与异氰酸酯的氨基甲酸酯化，由于与氯甲酸酯和羧酸的反应条件较为苛刻，目前常用的主要是酰氯或酸酐衍生物。由于酯化反应为可逆反应，CDR遇水亦可水解，因而反应体系中应无水。

(4)硫醇、醛、酮等药物的衍生化反应:由于硫醇类药物中的巯基本身以及生成的衍生物稳定性都较差，用于这类药物的手性分离分析的方法并不多见。含羰基的化合物能够发生多种化学反应，但是与之反应并用于手性拆分的试剂很少，虽然可利用含肼基(－NHNH2)的试剂与之反应生成腙和肟进行手性拆分，但拆分效果不理想。

CDR法的优点是:①可采用通用的非手性柱分离;②通过衍生化反应可以提高检测的灵敏度;③分类条件简单;④分离效果好。但是CDR法也不可避免地存在一些缺点，如:①分析物结构中必须有可被衍生化的基团;②衍生化反应需要高光学纯度的手性试剂;③两个对映体衍生化速率和平衡常数应一致;④衍生化和色谱分离过程中不能发生消旋化。

5.应用实例

实例:大环抗生素手性固定相HPLC法对大鼠血浆中的特他洛尔的立体选择性分析

特他洛尔(Tertatolol)是一种无内在拟交感神经活性的非心脏选择性β－受体阻滞剂，其分子结构中含有一个手性中心(如图9－5所示)，用于治疗高血压和伴肾功能不全的高血压。经研究，(+)－特他洛尔对映体的血浆清除率和分布容积低于(－)－特他洛尔对映体，且(－)－特他洛尔的效应是(+)－特他洛尔的50倍，所以评价体液中特他洛尔的每个对映体是非常重要的。本实验采用大环抗生素作为手性固定相优势有三:一是大环抗生素既含酸性基团又含碱性基团，适用范围广;二是大环抗生素有必要的手性识别结构;三是大环抗生素结构中既有亲水基又有疏水基。

(1)色谱条件

色谱柱:Chirobiotic V(150 mm×4.6 mm);流动相:甲醇－冰醋酸－三乙胺(100 0.01 0.015，v/v/v)，使用前0.2μm微孔滤膜过滤;流速:0.8 mL·min－1;紫外检测波长:220 nm;阿罗洛尔(Arotinolol)为内标。

(2)样品处理

取大鼠血浆样品6份(每份0.5 mL)，其中3份加入10μg·ml－1(－)－特他洛尔1.5μL、20μL、40μL，其余3份加入10μg·ml－1(+)－特他洛尔1.5μL、20μL、40μL，然后分别加入40μg·ml－1内标100μL，以去离子水稀释至1 mL，超声5 min，得到分别含有两种对映体15 ng·mL－1、200 ng·mL－1和400 ng·mL－1的样品。空白对照组取空白的大鼠血浆样品加去离子水同法操作。所得样品经固相萃取后，取100μL洗脱液进HPLC色谱仪。

图9－5　(－)－特他洛尔(a)、(+)－特他洛尔(b)、阿罗洛尔(c)的化学结构

(3)实验结果

用所建立的方法测定样品，如图9－6所示，(+)－特他洛尔和(－)－特他洛尔的保留时间分别为9.48 min和8.53 min，能够达到基线分离，且空白血浆无干扰。线性范围均为5～500 ng·mL－1(r2=0.999)，检测限均为2 ng·mL－1，定量限均为5 ng·mL－1。(－)－特他洛尔的日内精密度和准确度RSD分别为3.2%～4.5%和0.6%～3.3%，日间精密度和准确度RSD分别为2.2%～3.5%和0.8%～2.7%;(+)－特他洛尔的日内精密度和准确度RSD分别为2.3%～4.4%和0.8%～3.2%，日间精密度和准确度RSD分别为2.3%～3.6%和0.9%～2.5%，均符合相关要求。表明所建立的方法专属性强、灵敏度高、选择性好，能够用于血浆中特他洛尔对映体的快速分析。

图9－6　空白血浆色谱图(a)、含(－)－特他洛尔(Ⅰ)和(+)－特他洛尔(Ⅱ)及内标(Ⅲ)(b)的色谱图