分析条件的选择和优化

二、LC/MS分析条件的选择和优化

1．离子源的选择在法医毒物分析领域中，最常使用的两种电离源是ESI和APCI。在实际应用中，该二者表现出它们各自的优势和弱点。通常，中等极性到强极性的化合物适用于ESI电离方式分析，而非极性或中等极性小分子化合物的分析适宜采用APCI。

2．电离模式的选择无论是ESI还是APCI，这两种电离源均具有正负两种电离模式。一般而言，碱性化合物适宜采用正离子模式检测，若采用ESI电离，对待检样品可用乙酸、甲酸或三氟乙酸加以酸化，以提高样品的离子化效率。若已知待测物的pKa，流动相pH值一般调节至比其pKa值低2个单位。而酸性化合物适宜采用负离子模式检测，可用氨水、四乙铵、四甲铵或三乙胺对样品进行碱化来提高离子化效率，流动相pH值一般调节至比其pKa值高2个单位。样品中若含有较多的强负电性基团，如含氯、溴和多个羟基时，可尝试使用负离子模式检测。若样品中含有仲胺基或叔胺基，则可优先考虑正离子模式。有些酸碱性并不明确的化合物，可先选用APCI（+）进行观测结果，然后采用其他方式，如果正负模式都能出峰，则应选择灵敏度更高的方式。

3．流动相的选择LC/MS多采用反向液相洗脱，水、乙腈及甲醇是常用的理想溶剂，可根据分析物的化学性质按一定比例混合，组成不同的体系。在满足分离条件前提下，一般尽可能选择高比例的有机流动相。LC/MS流动相中常添加一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱（如甲酸、乙酸、氢氧化铵和氨水等）调节pH值，提高分离度。但添加物的浓度不宜过高，以避免ESI产生电离抑制。一般乙酸铵浓度不宜超过5～10 mmol/L，甲酸（或乙酸）含量应在0．01%～1%（体积分数）范围内。其他常用的调节剂还包括三氟乙酸（TFA）、三乙胺（TEA）、四氢呋喃（THF）等，TFA含量应＜0．1%（体积分数），三乙胺含量应＜1%（体积分数）。应保持挥发性缓冲剂和改良剂的浓度＜20 mmol/L，以减小ESI的电离抑制。

LC/MS不适合采用非挥发性盐、无机酸作为溶剂，缓冲液应避免使用碱金属磷酸盐、硼酸盐等缓冲体系，流动相中不能添加表面活性剂或洗涤剂。流动相中盐分太高时会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器，钠离子和钾离子的浓度必须低于1 mmol/L。

4．流量和色谱柱的选择流量的大小对于LC/MS分析十分重要。一般而言，不加热ESI的最佳流速是1～50 μL/min，应用4．6 mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用1～2．1 mm内径的微柱（超高速LC/MS）。APCI的最佳流速1 mL/min，常规的直径4．6 mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用小于100 mm的短柱［对于HPLC/UV分析，其UV图上并不能获得完全分离，但由于质谱定量分析时使用多反应监测（multiple reaction monit Oring，MRM）功能，所以不要求各组分完全分离］，这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。

5．辅助气体流量和温度的选择雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20℃左右即可。对于热不稳定性化合物，要选用更低的温度，以避免显著的分解。选择干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和小一点的流量。

6．质谱扫描方式的选择

（1）单极质谱单极质谱主要有全扫描（full scan）和选择反应监测（selected reaction monitoring，SRM）2种扫描方式（图30－6）。采用全扫描法时，能得到较全面的机构信息，但背景干扰大，灵敏度低，对于复杂生物样品的实际应用受到一定限制。而采用SRM方式检测已知目标化合物，具有一定选择性，灵敏度较全扫描约高2个数量级，但背景干扰仍较大，多用于定量分析，定性分析至少需3个碎片离子与标准物质碎片离子相吻合。

图30－6　全扫描（左）和选择反应监测（右）扫描方式

（2）串联质谱串联质谱常见的扫描方式有4种：多反应离子扫描、子离子扫描（product ion scan）、母离子扫描（precursor ion scan）、中性丢失扫描（neutral loss scan）（图30－7）。

多反应离子扫描：由MS₁选择1个或几个特定离子，经碰撞裂解后，在子离子中选出一特定离子，只有同时满足MS₁和MS₂选定的一对离子时，才有信号产生。这种扫描方式灵敏度高，选择性强，干扰物质的影响小。一般来说，定性分析至少需要两对离子与标准物质吻合。

子离子扫描：由MS₁选择一定的母离子经CID碎裂之后，MS₂扫描并记录产生的子离子。这一扫描方式，通过软电离技术得到的分子离子可进一步裂解，以获得分子的结构信息，特别适用于对物质结构的分析。

母离子扫描：选择MS₂中的某一子离子，测定MS₁中的所有可产生这一子离子的母离子。该方式能帮助追溯碎片离子的来源，能对产生某种特征碎片离子的一类化合物进行快速筛选。

中性丢失扫描：MS₁和MS₂同时扫描，但MS₂与MS₁始终保持质量差（Δm），最终的质谱图将显示那些来自一级质谱图中通过裂解丢失中性碎片（Δm）的离子。中性丢失谱最能反映化合物的特定官能团。

目前，多反应监测广泛应用于法医药毒物的广谱筛选分析和确证分析，后3种扫描方式在药毒物的未知代谢物的筛查和代谢机制研究方面具有非常诱人的应用前景。

而离子阱质谱仪属于时间串联型质谱，由其工作原理可知，离子阱可获得多级质谱，因此它的扫描方式多采用多级子离子谱功能，来获得物质的定性确证信息。但是利用计算机处理软件，也可以提供母离子谱、中性丢失谱和多反应监测谱。

图30－7　串联质谱4种扫描方式示意图