毛细管电泳分离条件选择

毛细管电泳分离条件的选择是毛细管电泳学习中的重点和难点。主要包括分离模式、检测方式、分离电压、毛细管温度、毛细管尺寸和涂层、分离介质的选择等。

前面我们已经介绍了毛细管电泳有很多不同的分离模式。首先我们要尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成及其性质，并根据样品的性质来选择合适的分离模式。毛细管电泳的多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会，这对复杂样品的分离分析，是非常重要的。若无样品信息可按简单原则先选自由溶液的CZE，根据实验结果再进行后续调整为免疫亲和毛细管电泳(ACE)或毛细管等电聚焦(CIEF)等。最后还可以选择填充形式的分离模式如毛细管凝胶电泳(CGE)或填充式毛细管电色谱(PC－CEC)，但是值得注意的是，填充型毛细管电泳不适合用于颗粒样品的分离，也不适用于大分子分离。有时我们分析的目的可能并不是单一的，这时分离模式的选择就要考虑其通用性，实际中分析的样品五花八门，性质各异，必须灵活多变地选择适合的分离模式。

毛细管电泳的检测方式有柱上及柱后两种，除与质谱与核磁联用外，通常采用柱上检测方式，有关联用技术我们将在下一节详细介绍。虽然激光诱导荧光检测器具有极高的灵敏度，但是其造价高，而且通常需要对样品进行衍生化方能检测，所以一般普遍采用紫外检测器。紫外检测器是一种相当成熟的检测方法，实际操作中，根据样品性质确定合适的检测波长即可，与色谱中的紫外检测器使用方法基本相同。但是毛细管电泳中如果填充凝胶，则检测波长需要选择在210 nm以上，否则会因背景太强而无法检测出峰。对于一些没有紫外吸收的物质，能衍生化的，可以衍生化后再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等;不能衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试用电化学检测器进行检测。需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑使用质谱检测。

分离电压是毛细管电泳的一个重要参数。高电压是实现CE快速、高效的前提。电压升高，样品的迁移加大，分析时间缩短，但是根据分离度公式R=可知，电场强度对分离度的贡献有限，要使分离度增加1倍，电压必须增加4倍。增加电压还会使焦耳热迅速上升，基线稳定性降低，灵敏度降低。因此，相对较高的分离电压会提高分离度和缩短分析时间，但电压过高又会使谱带变宽而降低分离效率。理论和实验结果均表明，分离效率与工作电压之间存在极大值，也就是说毛细管电泳中存在最佳工作电压。最佳工作电压可以通过理论计算及实验测定两种方式来获得。如熊建辉等将功效函数法结合遗传算法用于碱性药物肾上腺素的手性毛细管电泳的多指标同时优化，采用Derringer功效函数法，建立了总功效函数与实验因素的定量关系，实数编码的遗传算法搜寻总功效函数的最大值，获得了多个优化分离条件，在这些分离条件下得到的总功效函数与均匀试验设计中最佳条件相比，平均提高了10.4%，获得了三指标同时优化的结果。但是理论计算过程复杂，对操作人员要求较高，因此实际操作中一般使用实验测定来计算最佳工作电压。在电泳条件下，改变电压来测定相应的电流，绘制出电压－电流曲线图。取电压－电流线性关系范围内最大的电压作为实际的分离电压。一般来讲，超出线性范围的电压焦耳热过大不宜选用。电解质浓度相同时，非水介质中的电流值和焦耳热均比水相介质中小得多，因而在非水介质中允许使用更高的分离电压。

毛细管温度也是毛细管电泳的一个重要参数，温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效率。温度对迁移的影响主要通过改变黏度来实现。温度增加，缓冲液黏度减小，管壁硅羟基解离能力增强，淌度增加分析时间减短，分析效率提高。但温度过高，会引起毛细管柱内径向温差增大，焦耳热效应增强，柱效降低，分离效率也会降低。此外，压力进样时，通过增加温度所造成的黏度减小可达到更大的进样量，温度从15℃升高到50℃时，进样体积将增加约70%。在蛋白质分析中，温度的变化还会影响蛋白质的构型或核酸与蛋白质的相互作用。因此，毛细管温度的选择与控制是非常必要的。一般来讲，温度选择应考虑热效应控制、重现性控制、分离效率控制和分离介质对温度的限制等因素。热效应控制是指避免溶液过热而沸腾或有气体产生，显然温度越低越好。重现性需要控制温度的波动对实验结果的影响。分离效率控制则需要根据样品的性质选择最佳的分离温度，其结果一般由实验来决定。多数情况下，在20～30℃之间进行电泳，能获得良好的分离结果。如若不然，则需调整或优化温度。优化多从室温开始，向上搜寻，若无结果，再向下搜寻。分离介质控制是指某些介质对分离温度有一定的限制，比如凝胶介质不能适应忽高忽低的温度变化，也不宜在过高或过低的温度中电泳。一般低温能增加峰高并降低检测基线的噪音和漂移，并且允许使用更高的分离电压，有利于提高分离度。但是，有些样品却需要高温才能获得分离。提高温度能降低许多有机缓冲体系的背景吸收，从而提高检测灵敏度。温度的选择依具体的样品和缓冲体系而定。

毛细管的选择包括毛细管尺寸和涂层。毛细管内径越小，分离效率越好，但是直径的减小会增加管子的侧面积体积比，不利于抑制吸附，同时又会造成进样、检测等技术上的困难，因此实际毛细管内径一般不低于20μm。在其他参数不变的条件下，毛细管长度增加，电流减小，因此有利于减少焦耳热，但同时增加了分析时间;反之，短柱的分析时间明显缩短，但容易造成过热。因此，柱子长短需根据实际情况进行选择，通常分离的有效长度控制在40～60 cm之间，但也有长达1 m或短至数厘米者。除内径和长度外，还有一个因素即管壁的厚度，标准毛细管的外径是375μm，有些商品毛细管的外径为360μm、160μm或165μm。厚壁管有助于改善整个散热环境，能减少聚酰亚胺涂层对散热的不利影响，同时也有利于温度的控制。

涂层是指采用物理涂敷或化学键合以及交联等方法在毛细管壁形成单分子层或交联的多分子层。由于涂层改变了毛细管壁的性质，因此可以改变被分离物质与毛细管壁的相互作用及电渗流。在进行大分子分离时，通常选用惰性涂层来阻止蛋白质与毛细管壁的相互作用，以达到减小蛋白质吸附的目的。近年来，随着毛细管电泳涂层柱技术的不断成熟和发展，商品化的涂层毛细管也开始广泛应用。如汪勇等人建立了毛细管电泳表征辣根过氧化物酶、人凝血酶、牛凝血酶及植物血球凝集素4种糖蛋白稳定性的分析方法。当使用没有涂层的熔融石英毛细管时，4种糖蛋白在毛细管内壁的吸附很强，在电泳过程中几乎不出峰或峰形严重扭曲。当使用具有涂层的商品化蛋白质电泳毛细管时，则可有效分离4种糖蛋白并应用于其稳定性表征。与此同时涂层也会引起电渗流的变化，电中性的涂层会抑制电渗流，而带正电的高分子涂层则会使电渗流减小甚至反转。实际使用中，要根据分离模式和样品性质的不同而选择不同的涂层。

分离介质的选择则包括缓冲溶液、添加剂、溶剂、pH、试剂浓度、分配相的选择与优化。这些参数与分离模式有关，毛细管区带电泳是CE中最简单而应用面最广的一种基本分离方式。其条件选择与控制也是其他分离模式的基础，因此下面将对CZE的选择进行重点介绍。毛细管区带电泳使用均一的、具pH缓冲能力的自由溶液为分离介质。这种介质称为电泳缓冲液(runing buffer)，简称缓冲液，它由缓冲试剂、pH调节剂、溶剂和添加剂组成。因此缓冲液的选择可以分为缓冲试剂选择、pH调节剂选择、溶剂选择和添加剂选择等部分。

缓冲试剂的选择主要由pH决定，而pH主要根据被分析样品的性质及分离效率进行选择，pH的选择是实验成败的关键因素。若样品的物化常数已知，可直接用μs=αiγi(μ0e)i计算出被分析组分的有效淌度μs，αi为被分析样品的第i级解离，γi为活度系数。使组分间μs差别最大的pH则为理论最佳pHb。然后pKa在pHb±1范围内，μs与样品接近且紫外吸收弱的化合物均可成为待选缓冲试剂，实验后再进一步选出更好的缓冲试剂即可。但实际样品的解离常数大多未知，难以用计算的方法得出pHb。此外pH还会影响电渗、毛细管管壁吸附力等难于计算的因素，因此必须用实验的方式来选择最佳pH。磷酸缓冲液紫外吸收低，pH缓冲范围较广，因此通常作为基础的缓冲体系。一般可用磷酸缓冲试剂，测试pH 2～13的分离情况，选定最佳pH范围后，再进一步选出更好的pH及缓冲试剂。除去磷酸缓冲体系，毛细管电泳中常用缓冲体系还有硼酸、柠檬酸、甲酸、乙酸等缓冲体系，此外也可选择更为方便的商品化试剂盒。实验结果显示，对于氨基酸、肽和蛋白质等两性样品来说，pH＜2或pH＞9时分离效果较好，而糖类的最佳pH通常在9～11，羧酸或其他样品则通常选择5～9的范围进行分离。

在多数情况下，仅由缓冲试剂和pH调节剂组成的缓冲液就可达到分离要求。分离不理想时可考虑更换缓冲试剂或pH调节剂。如果上述方法不能解决问题，应考虑加入添加剂。无机电解质如NaCl、KCl等是最简单的添加剂。较高浓度的电解质可以压缩区带，增加分离度，还能影响蛋白质等大分子在管壁上的吸附力。但是，高浓度电解质容易导致温度过高，反而使分离效率下降。过热严重时，管内会出现气泡，分离不能进行。用两性有机电解质代替无机电解质可克服过热问题。在pH=pI时，两性电解质净电荷为零，不参与导电。实验证明，两性电解质是分离蛋白质的有效添加剂。

另一类添加剂是非电解质高分子，如纤维素、聚乙烯醇、多糖、TritonX－100等。这类添加剂通过分子间的相互作用影响样品的权均淌度。当添加剂具有手性中心时(如环糊精)，可分离光学异构体。关于这类添加剂的选择，主要理论依据是“相似相溶”原理。选择和使用添加剂是改善分离有效的方法。但是此类添加剂种类繁多，也是实际操作中最难掌握的部分。

缓冲液一般用水配制，有时改用水－有机混合溶剂，能有效改善分离度或分离选择性，并使许多水难溶的样品得以用毛细管电泳分析。常用的有机溶剂主要是挥发性较小的极性有机物，如甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、甲酰胺等。如果全部使用有机溶剂，就成为非水毛细管电泳技术。

分离条件的选择是毛细管电泳学习中的重点和难点，根据前面讲述的有关知识，简单总结分离条件选择流程如图6－4所示。

图6－4　毛细管电泳分离条件选择流程