色层分离实验

一、实验目的和原理

用柱层析和薄层层析法从番茄中提取番茄红素和β－胡萝卜素。类胡萝卜素为多烯类色素，不溶于水而溶于脂溶性有机溶剂。本实验先用乙醇将番茄中的水脱去，再用二氯甲烷萃取类胡萝卜素。因为二氯甲烷不与水混溶，故只有除去水分后才能有效地从组织中萃取出类胡萝卜素。根据番茄红素与β－胡萝卜素极性的差别，用柱层析可以将它们分离。分离效果可以用薄层层析进行检验。

二、材料与试剂

(1)材料:新鲜番茄(或番茄酱)。

(2)试剂:95%乙醇，二氯甲烷，石油醚(60～90℃)，氯仿，中性或酸性氧化铝(柱层析用)，环己烷，硅胶G，饱和氯化钠溶液，无水硫酸钠。

三、操作步骤

1．原料处理与色素提取

称取新鲜番茄酱20g于100mL圆底烧瓶中，加95%乙醇40mL，摇匀，装上回流冷凝管，在水浴上加热回流5min，趁热抽滤，滤液备用。向圆底烧瓶内，加入30mL二氯甲烷，水浴上加热回流5min，冷却，滤液备用，向圆底烧瓶内，再加10mL二氯甲烷重复萃取一次。合并乙醇和两次二氯甲烷提取液，倒入分液漏斗中，加5mL饱和氯化钠溶液(有利分层)，振摇，静置分层。分出橙黄色有机相，使其流经一个在颈部塞有疏松棉花且在棉花上铺一层1cm厚的无水硫酸钠的三角漏斗，以除去微量水分。将此溶液储存于干燥的有塞子的锥形瓶中。层析之前，将此溶液在通风橱中用热水浴蒸发至干。

2．柱层析分离

取一支长15cm左右、内径为1～1．2cm的层析柱，柱内装有用石油醚调制的氧化铝。将粗制的类胡萝卜素溶解于4mL二氯甲烷中，用滴管在氧化铝表面附近沿柱壁缓缓加入柱中(留1～2滴供以后的薄层层析用)，打开活塞，至有色物料在柱顶刚流干时即关闭活塞。用滴管取几毫升石油醚，沿柱壁洗下色素，并通过放出溶剂至柱顶流干，从而使色素吸附在柱上。然后加大量的石油醚洗脱。黄色的β－胡萝卜素在柱中移动较快，红色的番茄红素移动较慢。收集洗脱液至黄色的β－胡萝卜素从柱上完全除去，然后用极性较大的氯仿作洗脱剂洗脱番茄红素(注意更换接收瓶)。将收集到的两个部分在通风橱内用热水浴蒸发至干。将样品分别溶于尽可能少的二氯甲烷中，尽快进行薄层层析。

3．薄层层析检验

在用硅胶G铺成的薄板上距离底边约1cm处，分别用毛细管点上三种样品，中间点为经步骤1分离的粗提液，两边分别点上分离得到的β－胡萝卜素和番茄红素。可以多次点样，即点完一次，待溶剂挥发后再在原来的位置上点样。但要注意，必须在同一位置上点，而且样品斑点尽量小。点样时毛细管只要轻轻接触板面即可，切不可划破硅胶层。样品之间的距离为1～1．5cm。将此板放入装有环己烷作展开剂的层析缸中，盖上盖子。切勿让展开剂浸没样品斑点。待溶剂展开至10cm左右时，取出层析板。因斑点会氧化而迅速消失，故要用铅笔立即圈出。计算不同样品的比移值Rf，比较不同样品比移值大小的原因以及分离效果。

四、注意事项

(1)新鲜番茄酱的制备:将新鲜番茄洗净，用捣碎机捣碎或用市售的番茄酱。

(2)氧化铝层析柱的装填方法:称取15g中性氧化铝置于50mL锥形瓶中，缓慢加入15mL石油醚，不断搅拌直至成均匀浆液(稠厚但能流动)。同时将层析柱垂直固定于铁架上，关闭活塞;向层析柱内加入石油醚至半满，然后开启活塞让溶剂以每秒一滴的速度流出，用另外的50mL锥形瓶收集。摇动中性氧化铝浆液，缓慢倒入正在流出石油醚的层析柱中，并不断用带橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身，使顶部氧化铝保持水平，将收集到的溶剂在柱内反复循环几次，以保证沉降完全并充分填充柱身。

(3)硅胶G薄层板的制备。将4g硅胶G置于一小烧杯中，加入8mL蒸馏水不断搅拌至浆糊状，倾倒在洗净的玻板(18cm×6cm)上，流平，用涂布器铺板，并轻轻敲打以使涂布均匀，在室温放置半小时晾干，然后移入烘箱，缓慢升温至105～110℃活化半小时，取出放入干燥器中备用。