病毒分离样品的实验室处理方法

第一节　病毒分离样品的实验室处理方法

病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。

一、组织器官样品的处理

1.用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1～2ml Hank’s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1～2ml继续研磨，逐渐制成10%～20%的悬液；

2.加入复合抗生素（注：Hank’s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制）；

3.以8000r/min离心15min，取上清液用于病毒分离。

二、粪便样品的处理

1.加4g的粪便于16ml Hank’s平衡盐溶液中制成20%的悬液；

2.在密闭的容器中强烈振荡30min，如果可能则加入玻璃球；

3.6000r/min低温离心30min，取上清液再次重复离心；

4.用450nm的微孔滤膜过滤；

5.加二倍浓度的复合抗生素，然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。

三、无菌的体液（腹水、骨髓液、脱纤血液、水疱液等）和鸡胚液样品

可不做处理，直接用于病毒分离。

四、样品的特殊除菌处理

样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。

1.过滤除菌　可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或200nm孔径的混合纤维素酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。

2.离心除菌　用低温高速离心机以18000r/min（15.24cm转子）离心20min，可沉淀除去细菌，而病毒（小于100nm）保持在上清液中。必要时转移离心管重复离心一次。

3.乙醚除菌　对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒、小PNA病毒等对乙醚有抵抗力）可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4℃过夜。取用下层水相分离病毒。

4.染料普鲁黄（Proflavin）除菌　由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。

五、待检样品中病毒的浓缩

对病毒含量很少的病毒样一般普通方法不易检测或分离出病毒，必须经过浓缩。常用浓缩方法如下。

1.聚乙二醇（PEG）浓缩法　将分子量6000的PEG逐步加入经一般处理的样品溶液中，使终浓度为8%，置4℃过夜。以3000r/min离心15min，用少量含复合抗生素的Hank’s平衡盐溶液重悬，必要时用450nm微孔滤器除去真菌孢子。

2.硫酸铵浓缩法　将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经过上述一般处理的样品溶液中，边加边搅拌，置4℃过夜。离心同上。

3.超滤器浓缩法　是一种高效率的浓缩方法，特别适合大体积的样品浓缩。

4.超速离心浓缩法　以4000r/min（15.24cm）离心60～120min，绝大多数病毒将沉于管底。用少量Hank’s平衡盐溶液悬浮病毒。这种方法回收效率很高。但仅用于小体积的样品。

六、病毒分离样品脂类物质的去除

有些病毒样品（如组织样品）脂类和非病毒蛋白含量很高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂（如正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等）抽提。方法是将预冷的等量有机溶剂等量加入样品中，强烈振荡后，1000r/min离心5min，脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中，病毒保留在水相中。应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抗性。