实验动物与病毒分离

第二节　实验动物与病毒分离

一、实验动物在病毒学中的应用

分离病毒，通过实验动物来扩增样品中的病毒，使其能够用普通方法鉴定病毒；病毒感染实验研究，借助感染范围鉴定病毒；繁殖病毒制备诊断抗原或疫苗；病毒的免疫学和血清学试验；制备免疫血清。

二、实验动物的分级

国内的实验动物目前分4级。

1.一级实验动物　也称普通动物（CV），饲养于开放系统或检疫屏障系统，要求无主要人畜共患病病原体和严重危害动物种群的微生物和寄生虫。

2.二级实验动物　也称清洁动物（CCV），饲养于简易屏障系统或屏障系统，要求无一级实验动物应排除的微生物、寄生虫和危害本动物种群的微生物和寄生虫。

3.三级实验动物　也称无特定病原体动物（SPF），饲养于隔离系统或屏障系统，要求无一、二级动物应排除的和对动物本身有危害或干扰实验结果的微生物和寄生虫。

4.四级动物　也称无菌动物（GF），饲养于隔离系统，要求无可检出的微生物或所有非植入的微生物和寄生虫。

另外还有悉生动物（GN），又称已知病原体动物，是指体内带有的微生物完全明确的动物。悉生动物是由无菌动物衍生而来，此种动物是无菌动物，系人为地将指定的微生物丛投入其体内，按投给微生物的种类又分为单菌（Monoxenie）、双菌（Dixenie）、三菌（Trixenie）或多菌（Polyxenie）动物。

三、实验动物的选择

选择用于分离病毒的实验动物的原则是要确认选择的实验动物的种类、年龄、性别对拟检查的病毒有最高的敏感性。实验动物的级别选择可根据实验性质而定。兽医学上常用于分离病毒的实验动物有家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡胚等，也常用自然易感动物如家畜、家禽等。

四、实验动物的接种

实验动物的接种必须选择对拟检查的病毒最敏感的途径，否则，即使接入大量病毒也有可能造成感染失败。分离不同病毒选择的实验动物及接种途径各有所不同，本节只介绍新生小鼠和鸡胚的常用接种途径。

（一）鸡胚羊膜腔或尿囊腔的接种

主要用于正黏病毒和副黏病毒的分离和增殖。

1.选用7～13日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒表面。

2.从气室上端（一般为大头端）打孔，在观察灯下用带有6号针头的注射器从孔中插入至尿囊腔和（或）羊膜腔中，接种0.1～0.2ml样品。羊膜腔的接种应注意向胚胎方向刺入。刺破羊膜腔的一个证据就是胚胎发生一个突然的运动，然后稍向回抽针，注入样品。每份样品接种3～4枚鸡胚。

3.用胶带或石蜡封孔，将气室向上放置，孵育于35℃～37℃。

4.每日用观察灯观察，弃掉24h内死亡的鸡胚，收集24h以后死亡的鸡胚，或72～120h收集活胚。

5.羊水和尿囊液的收集：将鸡胚置4℃下2～4h，用碘酒和酒精消毒表面，剥去气室上的蛋壳，用剪刀或镊子撕破壳膜和绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊液。吸完尿囊液后，用镊子夹住羊膜，用吸管穿入羊膜腔吸取羊水。

（二）绒毛尿囊膜接种

主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。

1.选择9～12日龄的鸡胚，用5%石炭酸（不用碘酒消毒，因为酒精溶液可经卵壳吸收，并在绒毛膜上产生病变）进行表面消毒。

2.在观察灯下选择血管较少的一侧，用电烙铁在卵壳上烙一个烤焦圈，或用自制针头钻（无针尖）沿定位线钻一个直径5mm的圆圈，但不能钻透。用刀片挑起一小片卵壳。另外，在气室上方用针头钻穿另外一个孔。

3.用一橡皮吸球从气室上的小孔轻吸气使胚内形成负压，使侧面开口处的绒毛尿囊膜下陷。

4.从侧面的开口用注射器通过壳膜插入约5mm深，将0.05ml的样品滴在下陷的绒毛尿囊膜上。缓慢抽出针头，用胶带将鸡胚上的两个开口全部封住。将气室端向上。于35℃～37℃孵育。

5.每日观察接种的鸡胚，弃掉24h内死亡的鸡胚。

6.绒毛尿囊膜的收获：将鸡胚放于卵架上，用碘酒和酒精消毒表面。从气室端剥去卵壳，用镊子夹住绒毛尿囊膜（或先将鸡胚倾入平皿中后，再用镊子夹住绒毛尿囊膜），用剪刀剪下绒毛尿囊膜。将绒毛尿囊膜平铺在平皿中，加入几毫升的Hank’s平衡盐溶液或PBS，置于暗色平面上，以便计数痘斑或病斑。

另外，也可采用简便接种方法，即直接从气室端打破卵壳，用眼科镊撕一小片绒毛尿囊膜上的内壳膜，然后滴加样品溶液。

（三）卵黄囊接种法

主要用于虫媒披膜病毒、衣原体及立克次氏体等的分离和增殖。

1.选用5～7日龄鸡胚（此期卵黄囊大，易接种，且有较大的表面积供病原体繁殖），于观察灯下画出气室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，用碘酊和酒精消毒气室端。

2.用针头钻在气室中央锥一小孔，用带有6号针头的注射器将样品沿小孔刺入约3cm，注人0.1～0.2ml接种物于卵黄囊内，随后用胶带或石蜡封孔。

3.置孵化箱内继续孵育，每天翻卵2次。弃掉24h内死亡的鸡胚（但东方型和西方型马脑炎可能在接种后15～24h内死亡）。

4.卵黄囊的收获：用碘酒和酒精消毒表面，用镊子去掉气室上的卵壳，用另一把灭菌镊子夹出卵黄囊（黄色容易辨认）放在灭菌平皿中，必要时用生理盐水冲去卵黄。也可将全部内容物倾入平皿中，然后剥出卵黄囊。对某些病毒的分离则要收集全部胚体。

（四）鸡胚静脉接种

选用5～13日龄鸡胚，在观察灯上标出一根大静脉。常规法消毒后，去除静脉上方的一小块卵壳。滴加一小滴灭菌矿物油于内壳膜上，使其变为透明。用带有4号针头的注射器将样品顺血流方向插入静脉内后注射。注射量为0.025～0.05ml。

（五）新生小鼠的几种接种途径

新生小鼠对多种病毒易感，是一种很常用的实验动物。一般选择出生24～48h的小鼠。常用以下三种接种途径。

1.皮下接种法：接种量0.1ml/只。

2.脑内接种法：接种量0.03ml/只。

3.腹腔接种法种：接量0.01ml/只。

4.鼠组织毒的收获：接种后每天观察2次，及时发现死亡、麻痹等病症。弃掉24h内死亡的小鼠，收集死亡或出现麻痹等症状的小鼠脑和胴体，制成10%的组织悬液用于诊断、鉴定，或接种适宜的组织细胞，或继续接种小鼠用于其他项目研究。若小鼠无任何症状，应继续盲传2～3代。若仍无任何症状则视为阴性。必要时需盲传3代以上。