病毒的分离与鉴定

二、病毒的分离与鉴定

(一)病毒的分离

由于病毒只能在易感的活细胞内以复制方式进行增殖，因此病毒的分离必须使用易感的活细胞。常用的方法　包括动物接种、鸡胚培养、组织培养。

1．动物接种　动物接种是最原始的分离病毒的方法　，常用的动物是乳鼠。现已很少用于临床实验室。目前仍在使用的小白鼠脑内接种用于分离和鉴定流行性乙型脑炎病毒或狂犬病病毒。

2．鸡胚培养　鸡胚接种是较早用于病毒分离培养的技术之一。一般采用9～12 d的鸡胚，按病毒种类不同，选择不同的接种部位(图21－4)。鸡胚接种目前仍是流行性感冒病毒分离培养最常用的敏感而特异的方法　。

图21－4　鸡胚接种途径示意

3．细胞培养　是目前病毒培养最常用的方法　。根据检测的病毒种类选用不同细胞株。

(1)原代细胞株:将新鲜的器官或组织破碎并用胰蛋白酶处理，再移入培养液中，数天后形成单层细胞，称原代细胞。原代细胞对病毒敏感但来源困难。

(2)二倍体细胞:原代细胞连续传代后仍保持二倍体的正常细胞，称二倍体细胞。但多次传代后会出现细胞老化和死亡。

(3)传代细胞系:指肿瘤细胞或二倍体细胞株传代过程中的变异并可无限传代细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、传代地鼠肾细胞(BHK21)、人喉上皮癌细胞(Hep－2)、传代非洲绿猴肾细胞(Vero)等。传代细胞系对病毒的感染性稳定，应用　广泛。

(二)病毒的鉴定

1．病毒在细胞中增殖的鉴定指标

(1)细胞病变效应(cytopathic effect，CPE):由病毒增殖引起的细胞改变，称细胞病变效应。可以通过普通光学显微镜观察CPE的特征初步确定病毒的种类。CPE常见的特征有细胞变圆、肿胀、皱缩、分散、溶解(如肠道病毒、鼻病毒);细胞融合成多核巨细胞(如疱疹病毒);细胞浆或核内出现包涵体(如狂犬病病毒、人巨细胞病毒)。不同病毒的CPE特征不同，可据此对感染病毒进行初步判定。但有包膜病毒以出芽方式释放子代病毒，不出现CPE或病变轻微不易察觉。

(2)红细胞吸附:某些病毒表面表达血凝素，能使感染细胞与加入的红细胞结合，称红细胞吸附现象，是病毒增殖的间接指标。

2．病毒感染性测定及病毒数量测定

(1)中和试验:病毒的细胞培养悬液与特异性抗体混合作用一段时间后，病毒失去感染能力，不再能吸附敏感细胞，即中和试验。

(2)空斑或蚀斑形成试验:单层细胞中被病毒感染导致死亡的细胞区叫空斑或蚀斑。一个空斑是由一个病毒颗粒感染引起的。根据空斑的形态和大小可初步鉴定病毒。

(3)血凝试验:含有血凝素的病毒接种鸡胚后，收集鸡胚尿囊液或羊膜腔液，加入家禽红细胞后出现红细胞凝集，称血凝试验，该试验可作为病毒增殖的指标。若将病毒悬液做不同的稀释，以血凝的最高稀释倍数作为血凝效价，可对病毒含量作半定量测定。

(4)50%组织细胞感染量(50% tissue culture infectious dose，TCID₅₀)测定:将待测病毒液做10倍稀释，分别接种单层细胞，经培养后观察CPE等指标，以能感染50%细胞的最高稀释度的病毒量为终点，经统计学处理计算TCID₅₀。该法以CPE来判断病毒的感染性和毒力。