病毒感染的实验诊断

（一）病毒的基本特性

1．一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器。遗传物质仅为一种核酸，外被蛋白质衣壳或包膜，只能在活细胞内寄生，以复制的方式增殖，近75%的临床微生物感染是由病毒引起。

2．形态结构。①大小和形状，测量大小的单位为纳米，形态可分：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。②基本结构，指病毒的核心、衣壳两部分。核心充满一种类型的核酸：DNA或RNA，构成病毒的基因组。核心还含少数功能蛋白，主要是病毒早期复制所需的一些酶。衣壳是包围在核酸外的一层蛋白质，由壳粒聚合而成，可保护核酸免受核酸酶及其他理化因素的破坏。③辅助结构，病毒成熟后以出芽方式释放时，获得包围在核衣壳外的宿主细胞成分。包膜嵌有病毒编码的糖蛋白，具有病毒的特异性。

3．增殖。须依赖宿主细胞，以自我复制方式增殖，复制周期可分为吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放6个阶段。若病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能组装或释放有感染性的颗粒，称为顿挫感染。因为病毒基因组不完整或基因位点改变而复制出不完整无感染性的病毒，称为缺损病毒。当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种增殖的现象，称为病毒的干扰现象。干扰现象是机体非特异性免疫的一部分，当一个细胞受到两种或以上的病毒感染时，还可出现双重感染、互补、加强、表型混合与病毒杂交等现象。

4．噬菌体。那些侵袭细菌等并在其中增殖，能引起细菌等裂解的病毒称噬菌体。噬菌体具有识别细菌表面特异受体的功能，这种特异性是极为严格的。噬菌体感染细菌后出现两种后果：一是噬菌体增殖并裂解细菌，建立溶菌周期；二是噬菌体在细菌内不增殖，其核酸整合于细菌染色体内，并随细菌分裂而将核酸传至子代细菌中，建立溶原状态。

（二）非寻常病毒

非寻常病毒是比病毒更小更简单的致病因子，又称亚病毒因子，包括类病毒、卫星病毒和朊粒等。朊粒不含核酸，主要成分是蛋白酶抗性蛋白，对理化作用抵抗力强，具有传染性，是引起传染性海绵状脑病的病原体，导致中枢神经系统退化性病变，引起牛海绵状脑病，俗称疯牛病。

（三）病毒的处理

1．采样 应在病人急性期或发病初期采样，根据不同病情采集不同标本，如鼻咽分泌物、脑脊液、血液、粪便等。

2．标本运送保存 大多数病毒抵抗力较弱，室温易被灭活，因此标本要快速处理，注意冷藏，4℃可保存数小时，长时间保存需－70℃。对于处理过程中易失去感染性的标本，冻存时应加适当保护剂如甘油或二甲亚砜等。

3．标本处理 凝固的血液需先离心，血清才可用于病毒分离，肝素抗凝全血、脑脊液、胸腔积液、水痘液以及尿液均可直接分离培养，有些标本如粪便等，常需复杂处理过程。

4．组织培养 包括器官培养、组织块培养和细胞培养，目前常用细胞培养。对不同的欲检测病毒要选择适当的培养细胞。根据细胞的来源、染色特征及传代次数分3种类型：①原代和次代细胞培养；②二倍体细胞株；③传代细胞系。

5．鸡胚接种 鸡胚常用于病毒的原代分离，如乙型脑炎病毒以接种卵黄囊为最佳，羊膜腔和尿囊腔适合于流感病毒和腮腺炎病毒，绒毛尿囊膜对痘类病毒和疱疹病毒非常敏感。

6．动物接种 常用新生小鼠或乳鼠分离病毒，需选择相应的敏感动物以及相应的合适部位（鼻内、皮内、皮下、脑内、腹腔内、静脉等），如嗜神经病毒（流行性乙型脑炎病毒）最好接种小鼠脑内。

（四）病毒的鉴定

1．初步鉴定。根据临床症状、生物学特征等初步判断病毒的科及属，如B组柯萨奇病毒仅对新生乳鼠有致病性，对成年小鼠无致病性；腺病毒可使细胞肿胀，颗粒增多，病变细胞聚集成葡萄状等；耐酸试验可将肠道病毒与鼻病毒大致区分开。

2．最终鉴定。选择适当的血清学方法进行最后鉴定，常用的有中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、免疫荧光试验、酶免疫试验等。

3．光学显微镜直接检查病毒包涵体。在普通光学显微镜下，胞质或胞核内的包涵体呈现嗜酸或嗜碱性染色，可作为病毒感染的辅助诊断，不是特异性试验。

4．电子显微镜直接检查病毒颗粒，可从病毒形态上作出明确的鉴别诊断。

5．利用特异性免疫血清检测标本中的病毒抗原。常用：免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫法、反相间接血凝和对流免疫电泳等方法。

6．检测IgM和IgG抗体常用：中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验及免疫扩散、放射免疫法及酶联免疫吸附法。IgM抗体在感染的早期出现，因此标本采集时间对检测结果影响很大。IgG抗体检测需采集感染急性期与恢复期双份血清，恢复期IgG效价必须比急性期增高4倍或以上才有诊断意义。

7．可用核酸杂交和PCR技术检测病毒特异基因片段，但检出病毒核酸并不等于检出具有传染性的病毒颗粒。

（五）常见的病毒

1．流感病毒 属正黏病毒科，具多形性，感染性较强。其结构由内至外为①核心：位于最内层，由核酸和核蛋白组成，核酸为单负股RNA，易发生基因重组，引起变异；核蛋白为型特异性抗原，抗原性稳定，很少变异。②基质蛋白（M蛋白）：位于包膜与核心之间，有保护核心与维持病毒外形的作用。③包膜：位于M蛋白外面，为脂质双层，镶嵌突出于病毒表面的两种结构蛋白，一为血凝素（HA），二为神经氨酸酶（NA），其抗原性是划分流感病毒亚型的依据。不耐热，对干燥、日光、紫外线以及甲醛、乙醇等均敏感。在呼吸道柱状上皮细胞内复制，随飞沫传播，依靠血凝素与相应受体结合，感染细胞。

2．副流感病毒 副黏病毒科、副黏病毒亚科、副黏病毒属，形态结构跟流感病毒类似，核酸为单负股RNA，不分节段。包膜嵌有两种糖蛋白刺突，一种为HN（henlagglutinin neuranainidase），有血凝和神经氨酸酶活性，有流感病毒HA的吸附作用；另一种为F（fusion），有使病毒进入宿主细胞并使病毒传播的作用。抵抗力弱，不耐酸，对热敏感。经感染者呼吸道分泌物通过人与人密切接触或气溶胶传播。

3．呼吸道合胞病毒 副黏病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属，单个病毒颗粒具有多形性，电镜负染色呈球形。核酸为单负股RNA，不分节段。包膜上的G蛋白作用类似流感病毒的血凝素蛋白HA，F蛋白为融合蛋白，介导病毒穿入和细胞融合。G、F蛋白均有较强的免疫原性，能刺激机体产生中和抗体。抗F抗体中和病毒能力比抗G抗体强。引起婴幼儿下呼吸道疾病最常见的病毒，经飞沫传染。

4．腺病毒 无包膜病毒，核心为单一线形双股DNA，不能在鸡胚中增殖，只能在人源组织细胞中增殖。细胞病变可聚集成葡萄串状，细胞核中形成嗜碱性包涵体。对酸和乙醚不敏感，对低温耐受，56℃，30min可被灭活。常年流行，引起呼吸道疾病，机体在病毒感染后可获得对同型病毒的持久免疫力。

5．麻疹病毒 副黏病毒科、麻疹病毒属，核心为单负链RNA，三种衣壳蛋白（L、P、N），外被包膜，包膜内为M蛋白，表面有血凝素（H蛋白）和融合蛋白（F）。H蛋白与病毒受体CD46结合，感染宿主。病毒抵抗力不强，对阳光和一般消毒剂敏感。是儿童时期最常见的急性呼吸道传染病，飞沫传播，冬春季易发。

6．风疹病毒 核心为单正链RNA，外被包膜，表面有血凝素，能在绿猴肾、兔肾和人胚肾细胞内增殖，抵抗力不强，不耐热，对脂溶剂敏感，紫外线能灭活病毒。为急性呼吸道传染病。

7．肠道病毒 由简单的衣壳和单股RNA组成。能在猴肾、人胚肾、人羊膜细胞、HEPL2、HeLa细胞中增殖，最适生长温度为36～37℃，抵抗力较强，在污水及粪便中可生存数月。对酸及乙醚稳定，对紫外线、干燥及热敏感，56℃，30min可灭活。经粪－口途径传播，病毒的靶器官以神经系统、肌肉和其他系统为主，脊髓灰质炎病毒可损害脊髓前脚运动神经细胞，导致脊髓灰质炎（小儿麻痹症）。

8．轮状病毒 核心含双链RNA，外被双层衣壳，内层核衣壳的壳粒呈放射状排列，犹如车轮状外形。常用的细胞为原代猴肾细胞和传代猴肾细胞。抵抗力强，耐酸碱，耐乙醚，56℃，30min可灭活，可被消毒剂灭活。是引起婴幼儿急性腹泻的主要病因，A组感染引起婴幼儿急性胃肠炎，B组引起成人腹泻，无明显季节性。

9．乙脑病毒 基因组为单正链RNA，其结构蛋白有3种：M、C和E。M位于包膜内面，C在衣壳中，E是镶嵌在包膜上的糖蛋白，组成血凝素。出生2～3d的乳鼠为最易感动物，经脑内接种后3～5d即可发病。病毒抗原性稳定，很少变异。通过三带喙库蚊叮咬传播，猪为最重要的宿主和传染源。

10．登革热病毒 形态结构与乙脑病毒相似，由抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型，可用蚊体胸内接种培养，也可用白纹伊蚊的传代细胞（C6／36株）或地鼠肾细胞进行培养，可用初生小鼠进行动物接种。病毒储存于人和猴，通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等传播。感染人体后，在毛细血管内皮细胞和单核细胞中增殖，引起发热、肌肉和关节酸痛、出血及休克等。

11．汉坦病毒 核酸为单负股RNA，有长、中、短三个片段。可在人肺传代细胞（A549），非洲绿猴肾细胞（Vero－E6），人胚肺二倍体细胞（2BS）及地鼠肾细胞中增殖，易感动物有多种：黑线姬鼠、长瓜沙鼠、大鼠、乳小鼠、金地鼠等。对脂溶剂敏感，对酸抵抗力弱，60℃，1h可被灭活。可引起肾综合征出血热（HFRS），有2周的潜伏期，可引起流行性出血热，起病急，典型临床症状为高热、出血和肾损害，伴有三痛（头痛、眼眶痛、腰痛）及红（面、颈、上胸部潮红）。

12．单纯疱疹病毒 为有包膜的DNA病毒，由长片段（L）和短片段（S）组成，为双股线状DNA。该病毒能在多种细胞内增殖，如原代兔肾、人胚肺、人胚肾细胞或地鼠肾细胞等。细胞被感染后很快出现嗜酸性核内包涵体。可感染的动物种类较多，如家兔、豚鼠、小鼠等。该病毒有两种血清型，HSV－1和HSV－2。可通过直接接触和性接触传播，也可经飞沫及垂直传播。

13．水痘－带状疱疹病毒 基本特性与HSV相似，为线状双股DNA病毒。一般实验动物及鸡胚对VZV均不敏感，但能在人胚二倍体肾细胞（HFDK）或人胚二倍体肺细胞（HFDL）中增殖，受感染的细胞出现嗜酸性核内包涵体和多核巨细胞。可引起水痘和带状疱疹，前者为原发感染引起，后者为复发感染所致，主要发生于儿童，带状疱疹多发生于成人和老人。

14．巨细胞病毒 形态与基因组结构与HSV极为相似，但感染的宿主及细胞范围均狭窄，且种属特异性高，即人CMV（HCMV）只能感染人。HCMV体外培养只能在人成纤维细胞中才能增殖。细胞培养中增殖缓慢（需2～6周），细胞核变大形成巨大细胞，内有致密的嗜碱性包涵体，形似猫头鹰眼特征。56℃30min，低pH、乙醚、紫外线、反复冻融均能使CMV灭活。病毒可通过多种途径传播：正常人感染，免疫功能缺损的个体感染，先天性和围生期感染。

15．EB病毒 形态与其他疱疹病毒相似，不能用常规的疱疹病毒培养方法进行培养，一般用人脐血淋巴细胞或从外周血分离的B淋巴细胞培养。由病毒抗原表达时所处的增殖周期不同，可将EBV抗原分为3类：①潜伏期表达的抗原，包括EBV核抗原（EBNA）和潜伏期膜蛋白；②EBV增殖早期抗原（EA）；③病毒增殖晚期抗原，包括EBV衣壳抗原（VCA）及EBV包膜抗原（MA）。流行广泛，主要经唾液传播，也可因输血传染。主要侵犯B淋巴细胞。

16．甲型肝炎病毒 无包膜，核心为单正股RNA，抵抗力较其他小RNA病毒强，60℃10～12h后仍具感染性，85℃立即灭活，对乙醚、氯仿及pH 3的酸性环境有抵抗力。微生物学检查以测定病毒抗原或抗体为主。感染早期一般用RIA或ELISA检测病人血清中抗－HAVIgM。可引起甲型肝炎，主要通过粪－口传播，传染源多为人。

17．乙型肝炎病毒

（1）形态与结构：3种特有颗粒。①大球形颗粒：具感染性的HBV完整颗粒，呈球形，又称Dane颗粒。外衣壳相当于一般病毒的包膜，HBV的表面抗原（HBsAg）镶嵌于包膜的脂质双层中。内衣壳位于外衣壳里面，是HBV的核心抗原（HBcAg）。用酶或去垢剂作用后，暴露出e抗原（HBeAg）；②小球形颗粒：成分为HBsAg，无传染性，不含病毒核酸DNA及DNA多聚酶；③管形颗粒：成分为HBsAg，由多个小球型颗粒“串联而成”，不含病毒核酸。基因组为双链DNA环状，长链为负链，短链为正链，高度压缩，重复利用。

（2）抗原成分：有HBsAg、HBcAg、HBeAg。①HBsAg是HBV感染的主要标志物，由病毒DNA的S区编码；②HBcAg由病毒DNA的CORF编码，免疫原性强，抗－HBcIgG血清中持续时间长，抗－HBcIgM提示HBV处于复制状态；③HBeAg为可溶性蛋白质，由病毒DNA的CORF编码，作为HBV复制及具有强感染性的一个指标。

（3）抵抗力：对理化因素抵抗力较强，60℃，10h，98℃，1min，乙醚、pH 2．4的酸性环境6h均不能有效灭活病毒。

（4）常采集血液标本检测HBV的血清标志物，方法主要为RIA和ELISA等，其中HBsAg的检测最为重要，可发现无症状携带者，是献血员筛选的必检指标。

（5）可致乙型肝炎，主要通过破损皮肤和黏膜侵入机体，传染源为HBV携带者及患者的血液、唾液、精液和阴道分泌物等，传播途径可分为血液传播、性传播、母婴传播。

18．丙型肝炎病毒 有包膜的单正股RNA病毒，可感染黑猩猩并在体内连续传代，引起慢性肝炎，不能用体外细胞进行分离。抗原成分主要有核衣壳蛋白、包膜蛋白及非结构蛋白。对各种理化因素抵抗力弱，对酸、热均不稳定。沸水5min或60℃，30min均可丧失感染性，对氯仿、乙醚等有机溶剂敏感。主要经输血或其他非肠道途径（如共用针头、血透析等）传播。

19．丁型肝炎病毒 核心含HDV抗原（HDAg）和HDVRNA基因组，基因组为单负链环状RNA，外为HBsAg。HDV不能独立复制，需HBV辅助才能增殖，对HDV敏感的动物有黑猩猩、东方土拨鼠等。HDV感染通常引起严重和进行性的肝病，传播方式主要是经血传播，也通过密切接触及母婴垂直传播，只有在感染了HBV的人群或是与HBV同时侵入才能发生。

20．戊型肝炎病毒 无包膜，基因组为正单股RNA，体外培养不易成功，敏感动物为灵长目，如猕猴和黑猩猩，对高盐、氯化铯、氯仿和反复冻融敏感。HEV可引起戊型肝炎，主要经粪－口途径传播，患者多为成人，未成年者大多为隐性感染。

21．人类免疫缺陷病毒 有HIV－1和HIV－2两型，1型是引起全球艾滋病的病原体，2型主要存在非洲西部。

（1）基本特性。①为RNA病毒，核心含有RNA、逆转录酶和核衣壳蛋白，外被为脂蛋白包膜，其中镶嵌有gp120和gp41两种特异的糖蛋白，gp120与CD4受体蛋白结合，gp41为跨膜蛋白。②包膜糖蛋白gp120与细胞上的CD4受体结合，包膜与细胞膜发生融合。核衣壳进入细胞质内脱壳，释放核心RNA。逆转录酶发生作用，以RNA为模板进行复制。子代RNA与一些合成的结构蛋白装配成核衣壳，从宿主细胞膜获得包膜，形成有感染性的子代病毒，以出芽方式释放到细胞外。③病毒受体与细胞亲嗜性，HIV的主要靶细胞是CD4T淋巴细胞和单核－巨噬细胞亚群。CD4是HIV的主要受体，还有两种辅助受体CXCR4和CCR5，前者是HIV的亲T细胞病毒株的辅助受体，后者是HIV的亲巨噬细胞病毒株的辅助受体。④在体外仅感染表面有CD4受体的T细胞、巨噬细胞，因此常用新鲜分离的正常人T细胞或病人自身分离的T细胞培养病毒。⑤抵抗力较弱，56℃，30min可灭活，可被消毒剂灭活，但室温病毒活性可保持7d。

（2）检验。病毒标志是指病毒培养或用分子生物学方法直接从感染者体内分离HIV或其基因物质。免疫标志是指HIV抗原及抗体等免疫复合物。检测方法有：①抗原检测，常用间接ELISA法检测p24抗原。②抗体检测，常用方法有初筛试验：酶联免疫吸附试验（ELISA）、酶免法（EIA）、免疫荧光法（IFA）、凝集试验；确证试验：免疫印迹试验（Western bolt，WB）、放射免疫沉淀试验等。③相关标志，是指与艾滋病病情发展或HIV感染密切相关的，存在于体内的某些化学物质，如CD4细胞、新蝶呤、白细胞介素等。

（3）致病性。HIV是获得性免疫缺陷综合征（AIDS，艾滋病）的病原体。AIDS的主要特征：侵犯CD4细胞为主，造成细胞免疫功能缺陷，继发体液免疫功能缺损，传染源是HIV无症状携带者和HIV患者，传播途径主要为：性接触传播、血液传播、母婴传播。从HIV感染到发展为典型AIDS分4个阶段：急性感染期、无症状感染期、艾滋病相关综合征、艾滋病（艾滋病完全型）。

22．狂犬病毒 外形似子弹状，含单负股RNA，外为脂蛋白包膜，表面有许多糖蛋白刺突，与病毒的感染性和毒力有关，是一种嗜神经性病毒，可感染的动物范围较广。在易感动物或人的中枢神经细胞中增殖时，胞质内形成嗜酸性包涵体，称内基小体，在诊断上很有价值。可引起人类狂犬病，此病大多由病犬咬伤所致，也可因猫、狼以及其他带菌动物咬伤所致。发病时典型的表现是神经兴奋性增高，吞咽、饮水时喉头肌痉挛，甚至闻水声或轻微刺激包括光线均可引起全身痉挛发作，又称恐水病。最后因昏迷、呼吸循环衰竭而死亡。检验：人被犬和其他动物咬伤后，将该动物隔离，7～10d不发病，认为该动物没患狂犬病或咬人时唾液中无狂犬病病毒，若隔离动物观察期间发病，即取其海马回部组织做切片或涂片，用HE染色检查内基小体或用直接荧光抗体法（DFA）检测病毒抗原，或用ELISA法查抗原。

23．人乳头瘤病毒 由病毒衣壳和双链环状DNA组成，具宿主和组织特异性，只能感染人皮肤、黏膜上皮细胞，在易感细胞核内增殖形成核内嗜酸性包涵体，目前为止HPV组织培养尚未成功。HPV可通过性接触感染，引起尖锐湿疣，主要由HPV6引起。HPV16、HPV18、HPV31、HPV33等型别可引起宫颈内瘤样变，严重者可发展为浸润癌。根据病史及典型临床表现可作诊断，常用的方法有核酸分析、原位杂交、DNA印迹、PCR。