小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

项目六　小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

一、项目背景

小鼠胚胎成纤维细胞原代培养作为哺乳动物胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）培养最早和最常用的方法，由于取材容易、价格低廉，能产生抑制哺乳动物ES细胞自主分化和促进ES细胞增殖的一些因子，而且可以为ES细胞的培养提供类似于体内的微环境，在研究哺乳动物ES细胞培养中得到广泛的应用。

二、项目目标

（1）巩固细胞原代培养中常用的组织块消化法的操作要领；

（2）牢固掌握动物细胞培养中的无菌操作技术；

（3）培养学生良好的实验设计和实验操作习惯，以及解决问题和分析问题的能力，提高学生的综合素质。

三、工作流程

流程一：工作准备

流程二：操作方法

（1）将妊娠10～14d的小鼠用引颈法处死，然后将其整个浸入盛有75%酒精的烧杯中2～3s，取出后放入已经消毒的肾形解剖盘中，用普通手术剪、手术镊在孕鼠躯干中部环形切开皮肤，并将两侧皮肤分别拉向头、尾把孕鼠反包，暴露躯干部腹壁。用眼科剪、眼科镊沿腹中线纵向切开孕鼠腹肌和腹膜，暴露腹腔器官后取出含有胎鼠的两侧子宫，放入60mm培养皿中，剖开子宫体，取出胎鼠，将胎鼠在Hank′s液内洗去血液、羊水、胎膜等杂物后放入另一培养皿中。

（2）去除胎鼠头、尾及内脏，只留下胎鼠四肢及躯干部分，在Hank′s液内清洗2～3次去除血污后，放入60mm培养皿或青霉素小瓶内，用眼科剪、眼科镊反复将小鼠胎儿剪切成1mm³的小块。

（3）用弯头吸管吸取若干组织小块，置于培养瓶中。把组织小块分散接种到培养瓶底上，以小块相互距离5mm为宜，每25mL培养瓶可接种20～30块。

（4）放置好组织块后，轻轻将培养瓶翻转，使接种组织块的瓶底朝上，然后加入3～4mL培养液，盖好瓶盖，做好标记，将培养瓶放置于CO₂培养箱内37℃培养2～4h。待组织小块略干燥，能牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使组织液浸泡组织块，静置培养。

若使用消化法培养，则将组织块放入三角烧瓶内，加入10～30mL 0.125%胰蛋白酶，37℃磁力搅拌消化20min。然后加入少量血清终止消化。用几层无菌纱布过滤，取过滤液，800r／min离心5～10min收集细胞。弃上清液，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶中培养。

流程三：物品的清洗与归位、实验室的整理等

实验结束后，应将实验用器材根据情况进行清洗、整理归位、摆放整齐，打扫实验场地的卫生。

四、工作注意事项

（1）整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡在酒精中的时间不能过长，以保证胚胎细胞的活性；

（2）细胞接种浓度不宜过大，否则会影响细胞贴壁和生长；

（3）操作过程中动作一定要轻，减少振动，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养；

（4）要注意无菌操作。

五、思考题

（1）组织块培养时，怎样做才能使组织块粘贴牢固？

（2）如何提高原代细胞培养的成功率？

（3）组织块培养3～5d后换液的目的是什么？

（4）试述小鼠胚胎成纤维细胞原代培养的操作流程与注意事项。