原代肾间质成纤维细胞的分离培养

（一）实验目的

成纤维细胞作为肾间质中的固有细胞，在肾间质纤维化发生、进展上具有重要调控作用。掌握原代肾间质成纤维细胞的分离和培养技术，对于阐明肾间质纤维化过程中成纤维细胞的分化、成熟和增殖规律，研究肾间质纤维化发生和进展机制非常重要。

（二）实验试剂

1.Ⅴ型胶原酶（0.5mg/ml）。

2.细胞培养用液　10%FBS DMEM。

（三）实验流程

1.100～150gSD大鼠，乙醚麻醉，腹主动脉插管，全身肝素化。

2.灌注生理盐水，清洗肾脏2min，直到肾脏变白为止。

3.将肾皮质部分剪成细条置于100目钢筛上研磨。

4.生理盐水冲洗后于150目网筛上收集肾小管节段。

5.肾小管节段悬浮于10%FBS DMEM培养液，在冰上静置15～20min，弃上清。

6.重新悬浮于10%FBS DMEM，放入孵箱培养。

（四）注意事项

1.灌注要彻底，血液细胞对肾脏细胞生长有影响，尽量去除。

2.培养2～4d即可见细胞生长，每4～5d传代一次，连续传3代后肾小管上皮细胞逐渐死亡才可获较纯净的肾小管周围成纤维细胞。

（五）细胞鉴定

采用免疫荧光方法肾小管周围成纤维细胞抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscle actin，α-SMA）、波动蛋白（Vimentin）阳性，而抗细胞角蛋白及角蛋白染色为阴性。

（六）培养的肾小管周围成纤维细胞

见图1-7。

图1-7　光镜下的间质成纤维细胞形态（×100）

参考文献

[1]李文歌，陈香美，程庆砾，等.用共培养体系观察缺氧肾小管上皮细胞对成纤维细胞的调节作用.中华内科杂志，1996,35:810-813.

[2]李文歌，陈香美，程庆砾，等.肾小管周围成纤维细胞的培养及其细胞间黏附分子-1的检测.中国现代医学杂志，1996,6:5-6.

[3]李文歌，程庆砾，傅博，等.肾小管上皮细胞分泌因子和脂多糖对肾间质成纤维细胞的影响.中国实验临床免疫学杂志，1997,19:18-20.