其他分子生物学技术在医学昆虫学中的应用

20世纪70～80年代，分子生物学技术取得了长足进展，被广泛应用于医学、生物学和农学等各个领域。在医学昆虫学研究领域中，除PCR技术、反义核酸技术、RNA干扰技术、噬菌体表面呈现技术等有着较为广泛的应用外，其他分子生物学技术在媒介昆虫亲缘种的鉴定、昆虫体内病原体的检测、遗传防制等诸多方面均有应用。涉及到的技术包括限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、核酸序列分析（nucleic acid sequence analysis）、基因探针技术（gene probe）、扩增片段长度多态性技术（amplified fragment length polymophism，AFLP）、基因芯片技术（gene chip）等，使医学昆虫学在分子水平上的研究取得了丰硕成果。

（一）限制性片段长度多态性技术分析

限制性片段长度多态性技术分析是20世纪80年代中期发展起来的一种DNA多态分析技术，它用一定数目和种类的限制性内切酶（RE）对目标DNA序列进行酶切，因不同目标DNA的序列结构（遗传信息）有差异，RE在其上的识别位点的数目和距离便发生改变，因而产生相当多的大小不等的DNA片段。然后经Southern杂交可将与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱（较简单的靶序列，如mtDNA可以省却杂交，直接用电泳方法检测），作为亲缘种分类鉴定和种群进化的依据。

RFLP稳定性和重复性均高，具有种族特异性，对于分析一个分离群体的染色体片段具有重要价值，RFLP也是进行有益基因的分子标记定位、杂交优势的理论探讨和预测的有效手段，为昆虫分子生物学、昆虫生理学和昆虫分子生态学的研究提供了新的技术。Raymond（1991）用此技术研究了库蚊对有机磷农药抗性产生和扩散机制，证明导致库蚊抗性产生的酯酶B2基因具单一起源，并可通过迁飞扩散至不同地区。但RFLP需用放射性探针检测，耗资较大，其对样品纯度要求较高，多态性出现率低，只能检测内切酶识别位点上的变异，能提供的信息有限，其在医学昆虫学中的应用尚待进一步探讨。

（二）核酸序列分析

核酸序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，Sanger双脱氧链终止法和Maxam－ Gilbert DNA化学降解法是应用较多的两种快速序列测定技术方法。虽然其原理不尽相同，但这两种方法均生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或多种残基上，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由该种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。然后对各组寡核苷酸进行高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可区分仅差一个核苷酸、长度达300～500个核苷酸的单链DNA分子。经放射自显影后，即可从放射自显影胶片上直接读出DNA核苷酸顺序。目前，自动化测序已成为当今DNA序列分析的主流。除传统的双脱氧链终止法外，新的测序技术不断涌现。Pyrosequencing（焦磷酸测序）技术即是一项全新的DNA测序技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。

随着分子生物学的发展，对医学昆虫的研究已达分子水平，目前虽可用定量PCR、杂交（包括基因芯片）和DNA序列分析等方法对昆虫DNA序列进行研究，但只有DNA序列分析是黄金标准，该技术在医学昆虫研究中应用也较为广泛。胡友兰等（2003）对荒川库蠓（Culicoides arakawae）rDNA ITS2进行测序，并将荒川库蠓ITS2序列与残肢库蠓（C．imicola）和变翅库蠓（C．variipennis）以及白足按蚊（Anopheles albimanus）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）和有羽摇蚊（Chironomus plumosus）3种蚊的已知序列进行比较，发现3种库蠓的ITS2片段长度差异不大，均在205～250bp范围内；但库蠓的ITS2片段与蚊等其他双翅目昆虫比较，则差异不等。

刘先凯等（2002）对白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组中扩增出的defensin A基因进行序列分析后发现此两序列中存在内元。测序结果显示序列的长度分别为304bp和306bp，通过与defensin A的5个型同源性比较发现这两个序列除了分别多出一段66bp和64bp的序列以外，其他部分Ad－Def（A1～A4）具有很高的同源性，经分析多出的这一段DNA片段符合高等真核生物mRNA前体内元的典型特征。

此外，还可通过测定核苷酸序列来比较同源分子之间的相互关系。DNA序列分析可以保证使某一区段每个核苷酸位置上出现的变异都被发现，直接测定DNA序列可以测出所有的DNA变异，从而获得最为准确的遗传信息，可比较不同类群个体的同源核苷酸序列，据此建立分子系统发育树，并推断类群间的演化关系，是目前分子进化和系统发育研究的热点。

（三）基因探针技术

基因探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核苷酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段，因其核苷酸顺序与所要探测的基因相同或相似，可与目的基因形成杂交链。依照其来源和性质不同，可分为DNA探针、RNA探针及寡核苷酸探针等。用特异的基因探针与被鉴定的昆虫基因杂交，通过探针上带有的标记和信号放大系统进行检测，可用于昆虫近缘种和复合种的鉴定。此方法效果较好，但要求对研究类群的遗传背景有一定了解，且探针的制备也较麻烦，因此探针杂交技术通常多用于小型医学昆虫种类鉴定。

基因探针可用于昆虫基因克隆的筛选。因果蝇分子遗传学研究较其他昆虫深入，Benedict，M．Q．（1993）等采用果蝇Hsp70基因编码区作探针筛选克隆出美洲疟蚊（Anopheles albimanus）的热休克基因家族Hsp70。昆虫谷胱甘肽S转移酶（GST）与昆虫对杀虫剂的抗性有关，Reiss，R．A．（1993）等采用埃及伊蚊（Aedes aegypti）的GST编码cDNA作探针筛选克隆出疟疾媒介蚊虫冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）GST酶的基因。基因探针还可用于昆虫基因的定位。Kumar，V（1993）等利用生物素标记脱氧核苷酸前体，经PCR制备各种基因探针（包括酯酶基因、淀粉水解酶基因及5sRNA基因等），将这些基因在冈比亚按蚊多线染色体（polytenechromosome）上进行原位杂交，从而获得在蚊虫染色体上的定位。Salazr，C．E．（1994）等也用生物素基因探针对按蚊细胞骨架肌动蛋白（Actin）基因进行定位研究，发现该基因分布于1D，8D，16D，21C和43C染色体区，与5种不同的肌动蛋白基因对应。基因探针在昆虫基因表达分析中也有应用。通常采用Northern印迹法分析表达产物，所用探针均是标记的DNA分子。Shotkoski，F．等（1994）对按蚊肌动蛋白基因在卵期、幼虫期、蛹期和成虫期发育过程中的表达时相进行研究，发现其肌动蛋白基因以蛹期表达最高。Blanchetot，A．等（1993）用GABA受体亚基基因探针检测到该类抗性基因的黄热病媒介昆虫埃及伊蚊γ－氨基丁酸（GABA）受体亚基基因多表达，发现其与杀虫剂的抗性有关。

在医学昆虫分子生物学研究中，基因探针已是必不可少的重要工具之一。除了在昆虫基因克隆筛选、基因定位、基因表达分析中应用较为广泛外，基因探针技术在昆虫系统进化、分子生态学等研究领域中也有应用。

（四）扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymophism，AFLP）技术是由Vos．P和Zebeau M等将RFLP分析法和PCR法结合起来发展的一种新的基因组DNA多态性分析技术，故其具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性和简易性。该技术将得到的DNA样品先进行PCR扩增，然后用RE酶切，电泳。与RFLP相比最大的优点是：所需的DNA量少，不需Southern杂交，实验结果稳定，重复性较好，表现孟德尔遗传，每个AFLP反应可以检测的位点50～100个，多态性强，适宜于遗传多样性分析、种质鉴定、分子系统学研究。

埃及伊蚊是登革热病毒的主要传播者，Ravel等（2001）应用AFLP标记和微卫星标记来检测2个城市不同地区种群的埃及伊蚊的遗传多样性，以估计基因流动的水平。应用AFLP标记可得到从相同城市和同一地区的聚类结果，表明埃及伊蚊可能会从Guayme再次入侵到Hermosillo。因AFLP技术具有高度重复性、操作简易性等许多优点，使其可能取代部分常规的分子遗传标记技术。但与共显性遗传标记技术相比，AFLP不可能更准确地对种群遗传变异进行分析，因此AFLP技术与微卫星标记、DNA序列分析结合起来才能成为种群遗传变异研究中的主要工具。故目前AFLP技术在昆虫研究中的应用还不是很多，主要应用于生态型鉴定、种群遗传分析、连锁图谱构建等方面。

（五）基因芯片技术

基因芯片（gene chip）又称DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray），是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在硅片、玻片等载体表面，并以此为探针，在一定的条件下，与样品中待测的靶基因片段杂交，通过检测杂交后的信号，实现对靶基因信息的快速检测。基因芯片可以分为很多种类，常见并广泛应用的有cDNA微阵列和寡核苷酸原位合成。目前，基因芯片技术的应用领域主要有：基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和分型等。

基因芯片技术能对微量样品中的核酸序列进行检测和分析，其高通量、快速、并行化采集生物信息的特点更是优于其他传统的技术方法，该技术以一种系统、整体的方法进行研究，打破了“一种疾病、一种基因”的陈旧模式，整体宏观的研究生物体基因的表达及功能。田海生、朱昌亮等（2001）采用cDNA芯片结合抑制性差减杂交（SSH）等技术获得对溴氰菊酯抗药性和敏感性淡色库蚊的差异表达基因，并对其进行鉴定。结果正、反向抑制性差减杂交各获得523和286个克隆，经基因芯片鉴定后在抗性品系高表达的基因分别有155个（2～3倍）和42个（3倍以上），在敏感品系中高表达的基因分别有15个（2～3倍）和9个（3倍以上）。对3倍以上差异表达和特异表达基因进行单向测序，根据最高同源性比对结果，所获得的13个差异表达基因和2个特异表达基因与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗药性和敏感性相关。鉴定和克隆蚊疟原虫抗性基因对明确疟疾的传播机制并进一步提出新的疟疾控制措施是至关重要的。蚊中肠是疟原虫侵入的主要部位，疟原虫蚊体内发育的主要障碍是不能通过此部位，这可能是引起蚊疟疾抗性的主要原因。ChenH等（2004）对运用基因芯片技术获得的埃及伊蚊鸡疟疾敏感和抗性品系EST（中肠中已表达序列标志）mRNA基因差异表达进行RT－PCR和测序鉴定。结果表明，在敏感和抗性品系中有28个序列（2．3%）存在差异表达，其中27个序列表达差异达2倍以上。

基因芯片技术仍存在很多问题，如核酸杂交反应的特异度与检测灵敏度不够理想、制作方法复杂、样品处理繁琐、标记过程耗时以及价格昂贵难以普及等。此外，基因芯片上的基因必须为已知序列，很多基因的功能目前尚未研究清楚，有时尽管知道某基因的表达发生了变化，但无法知道这种变化的生理和病理学意义。基因表达终极结果是产生相应的蛋白质和酶，才能实现其各项生理功能，但基因与蛋白质功能并非完全平行，因此运用基因芯片技术进行医学昆虫学研究时，还需与其他检测蛋白质和酶的实验方法相结合。

仅有约20年研究历史的昆虫分子生物学技术已为我国医学昆虫学研究作出较大贡献，随着分子生物学理论、方法和技术的不断完善和提高，医学昆虫学研究机遇和挑战并存。分子生物学技术为医学昆虫学的进一步发展提供了新概念和新方法，必将在昆虫学基础理论、害虫治理和维护人类健康研究中做出新的贡献。